近期，南京大學(xué)張晶晶教授研究團隊針對上述新型PROTAC策略的局限性，以miRNA觸發(fā)的DNA編碼的pre-PROTAC的形態(tài)調節為依據，成功開(kāi)發(fā)出一種全新的miRNA啟動(dòng)的組裝pre-PROTAC平臺——miRiaTAC。

       傳統PROTAC技術(shù)所面臨的挑戰

       靶向蛋白水解嵌合體（PROTACs）作為一種極具前景的治療策略，通過(guò)利用細胞天然蛋白質(zhì)降解機制靶向消除疾病相關(guān)蛋白，展現出與傳統占位驅動(dòng)抑制劑不同的獨特優(yōu)勢，如在低劑量下發(fā)揮催化作用以及降解頑固蛋白等（圖1）。

圖1. 基于靶蛋白降解的各種嵌合體策略

       然而，在臨床應用中，PROTACs面臨著(zhù)諸多挑戰。

       首先，腫瘤選擇性差是一個(gè)突出問(wèn)題。由于無(wú)法精準區分腫瘤細胞和正常細胞，PROTACs在發(fā)揮作用時(shí)可能會(huì )對正常組織造成不良影響，降低了治療的特異性。這種缺乏腫瘤選擇性的特性可能導致治療效果受限，同時(shí)增加了患者出現副作用的風(fēng)險。

       其次，蛋白質(zhì)不受控制的降解帶來(lái)了非癌組織全身毒性風(fēng)險。PROTACs引發(fā)的蛋白質(zhì)降解若失去控制，可能會(huì )對正常組織和器官的蛋白質(zhì)平衡產(chǎn)生破壞，干擾人體正常的生理功能。這種全身毒性風(fēng)險不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能對治療的安全性和可持續性構成威脅。

       此外，過(guò)度激活也是PROTACs面臨的挑戰之一。過(guò)度激活可能引發(fā)一系列未知的生理反應或副作用，進(jìn)一步加重患者的病情或導致新的健康問(wèn)題。這種不確定性增加了治療的復雜性和風(fēng)險。

       因此，研發(fā)一種按需開(kāi)關(guān)策略，以實(shí)現選擇性激活和終止PROTACs介導的蛋白質(zhì)降解，成為當前迫切需要解決的問(wèn)題。這將有助于提高PROTACs的治療特異性和安全性，為其在臨床治療中的廣泛應用奠定基礎。

       新型PROTAC技術(shù)對副作用的優(yōu)化策略

       1、Nano-PROTACs策略

       2023年7月，國家納米科學(xué)中心的王浩研究員開(kāi)發(fā)了一種用于腫瘤治療的Nano-PROTACs技術(shù)，該技術(shù)旨在解決傳統PROTACs的問(wèn)題。其設計的Nano-PROTAC 系統由含特定結構域的兩個(gè)肽基前體組成，在腫瘤細胞高GSH水平下經(jīng)點(diǎn)擊反應自組裝成有序納米結構。

圖2. 原位自組裝Nano-protacs的示意圖

       體外研究表明，它能形成多元納米復合物，有效降解EGFR和AR等蛋白，且具有劑量依賴(lài)性和抗鉤效應。體內研究顯示，Nano-PROTACs可在腫瘤部位富集和保留，在荷瘤小鼠模型中呈現劑量依賴(lài)性的腫瘤抑制效果，通過(guò)降解靶蛋白誘導凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)該系統具有良好生物相容性和細胞選擇性。

       Nano-PROTAC技術(shù)雖然在蛋白降解領(lǐng)域顯示出巨大潛力，但仍面臨靶點(diǎn)單一、不能即時(shí)終止降解過(guò)程和制造成本昂貴等多方面的挑戰。

       2、Ligation to Scavenging策略

       在探索靶蛋白可控降解以及按需終止相關(guān)問(wèn)題的進(jìn)程中，中國藥科大學(xué)姜正羽教授研究團隊于2023年3月開(kāi)創(chuàng )性地提出了一種能夠即時(shí)終止蛋白降解過(guò)程的連接-清除（Ligation to Scavenging）策略（圖3）。

圖3. 受控的PROTACs和連接-清除系統示意圖

       該策略由經(jīng)反式環(huán)辛烯（TCO）修飾的樹(shù)枝狀大分子（PAMAM-G5-TCO）以及四嗪標記的PROTACs（Tz-PROTACs）這兩個(gè)關(guān)鍵部分構成。其中，PAMAM-G5-TCO能夠借助逆電子需求的Diels-Alder反應（IEDDA），快速且有效地清除細胞內處于游離狀態(tài)的PROTACs，進(jìn)而達成對靶向蛋白降解過(guò)程的終止調控。通過(guò)這一調控機制，那些已經(jīng)出現下調情況的靶蛋白能夠逐步恢復到正常水平。

       在研究過(guò)程中，研究人員針對BET蛋白、PARP蛋白等多個(gè)底物蛋白展開(kāi)了降解終止的相關(guān)實(shí)驗，充分論證了該策略具備可靠性以及廣泛的適用性，為PROTAC降解技術(shù)裝上了可靠的“剎車(chē)”。

       然而，該策略在選擇性和特異性方面可能會(huì )受到特定靶蛋白以及降解條件的限制，這一局限給這一頗具潛力的策略未來(lái)發(fā)展蒙上了一層陰影。

       3、DbTAC策略

       2023年7月，中國藥科大學(xué)馬祎教授研究團隊受到DNA框架所具備的可尋址性、可編程性以及剛性特質(zhì)的啟發(fā)，成功開(kāi)發(fā)出基于共價(jià)DNA框架的PROTACs（DbTACs）。這種DbTACs能夠借助簡(jiǎn)單的生物正交化學(xué)以及自組裝方式，實(shí)現高通量合成（圖4）。

圖4. 選擇性靶向蛋白降解的DbTACs平臺設計示意圖

       在其構建過(guò)程中，采用DNA四面體作為模板，此模板能夠精準地定義每個(gè)原子的空間位置?；谶@一特性，通過(guò)在模板上對POI和E3連接酶的配體進(jìn)行精確的定位操作，就能夠對配體間距進(jìn)行有效控制，其范圍可從8 Å到57 Å。研究人員經(jīng)研究發(fā)現，具有配體之間最 佳連接長(cháng)度的dbtac，展現出了更高的降解率以及更強的結合親和力。

       此外，具有三價(jià)配體組裝的雙特異性DbTACs（雙-DbTACs）表現出獨特優(yōu)勢，它能夠在確保對蛋白質(zhì)亞型進(jìn)行高度選擇性降解的同時(shí)，實(shí)現對多個(gè)靶點(diǎn)的消耗。而且，當運用不同類(lèi)型的彈頭，如小分子、抗體以及DNA基元時(shí)，DbTACs在針對多種靶標進(jìn)行降解方面彰顯出強大的功效，這些靶標涵蓋了位于不同細胞區室的蛋白激酶和轉錄因子等。

       DbTACs這一策略突破了傳統PROTAC分子僅能降解單一靶點(diǎn)的局限，然而，它也面臨著(zhù)一些挑戰，例如無(wú)法即時(shí)終止降解過(guò)程且不具有細胞選擇性等。

       4、Dual-PROTAC策略

       2021年5月，華中科技大學(xué)同濟藥學(xué)院李華教授研究團隊，鑒于單一靶點(diǎn)治療存在諸多局限，創(chuàng )新性地提出了雙靶向PROTAC分子（Dual-PROTAC）這一概念。

       受到雙靶向藥物的啟發(fā)，研究人員設計并合成了一種能夠同時(shí)對表皮生長(cháng)因子受體（EGFR）和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）進(jìn)行降解的雙靶點(diǎn)PROTAC分子。在合成過(guò)程中，研究團隊巧妙地運用天然氨基酸作為連接體，并選取吉非替尼、奧拉帕利以及CRBN或VHL的E3配體作為底物來(lái)合成相關(guān)分子（圖5）。

       圖5. Dual-PROTAC策略示意圖

       細胞實(shí)驗結果顯示，所合成的雙靶點(diǎn)PROTAC在SW1990和H1299細胞系中，能夠同時(shí)實(shí)現對EGFR和PARP的降解，并且其降解效果呈現出濃度和時(shí)間的依賴(lài)性。此研究首次成功實(shí)現一個(gè)小分子同時(shí)降解兩種不同靶蛋白，拓展了PROTAC技術(shù)應用并開(kāi)辟藥物發(fā)現新領(lǐng)域，然而該策略可能會(huì )由于分子量的增加，從而引發(fā)藥物性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)方面的一系列問(wèn)題。

       miRNA-觸發(fā)DNA編碼的前PROTAC平臺

       DNA具備可編程性，這一特性使其能夠構建多種多樣的納米結構，進(jìn)而為動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定了基礎。近期，南京大學(xué)張晶晶教授研究團隊針對上述新型PROTAC策略的局限性，以miRNA觸發(fā)的DNA編碼的pre-PROTAC的形態(tài)調節為依據，成功開(kāi)發(fā)出一種全新的miRNA啟動(dòng)的組裝pre-PROTAC平臺，即miRiaTAC。

       miRiaTAC的模塊化工具包含一對可修飾的DNA發(fā)夾H1和H2。在癌細胞中，靶miR -21呈現過(guò)表達的狀態(tài)，H1和H2能夠對其做出響應，并通過(guò)HCR形成交替共聚物。具體而言，彈頭JQ-1（L1）標記的H1可以招募靶蛋白BRD4，而H2與配體pomalidomide（L2）結合以招募CRBN E3泛素連接酶。精確確定L1和L2的修飾位點(diǎn)，以確保在miR-21啟動(dòng)時(shí)L1/L2對的鄰近性，使miRiaTAC誘導BRD4多泛素化，引起其蛋白酶體介導的降解，并形成（BRD4）m:miRiaTAC:(E3)n復合物（圖6）。

       圖6. 原位miRNA啟動(dòng)組裝預protac（miRiaTAC）系統的示意圖

       為了進(jìn)一步降低過(guò)度降解所帶來(lái)的副作用，研究人員設計了一種用于時(shí)空控制終止蛋白質(zhì)降解的概念策略。他們通過(guò)在合適的位置插入可光性基團，實(shí)現了對長(cháng)dsDNA納米結構拆卸過(guò)程的光學(xué)調節，從而構建出一個(gè)具有理想可控性的系統。針對多重蛋白降解這一挑戰，研究人員將另一種配體（L3）添加到H1上，以此來(lái)募集CDK6。借助可編程的配體比例，成功實(shí)現了正交多靶點(diǎn)降解（圖7）。此外，體內實(shí)驗也進(jìn)一步證實(shí)了miRiaTAC在小鼠腫瘤模型中展現出強大的抗癌活性以及顯著(zhù)的腫瘤抑制效果。

圖7. miRiaTAC的多重蛋白降解模式

       miRiaTAC策略通過(guò)插入光不穩定基團實(shí)現了對蛋白質(zhì)降解的時(shí)空控制終止，避免了過(guò)度蛋白降解。同時(shí)，研究人員設計了一種新的DNA編碼預PROTAC（H1-Pal），可實(shí)現單靶點(diǎn)和雙靶點(diǎn)蛋白降解，拓寬了miRiaTAC在多靶點(diǎn)治療中的應用。

       總之，miRiaTAC平臺解決了傳統PROTACs和miRNA療法的關(guān)鍵挑戰，為開(kāi)發(fā)下一代靶向癌癥治療提供了有前景的途徑。

       參考文獻：

       [1]Zhang, Ni-Yuan et al. “Nano Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) with Anti-Hook Effect for Tumor Therapy.” Angewandte Chemie (International ed. in English) vol. 62,37 (2023): e202308049. doi:10.1002/anie.202308049

       [2]Jin, Yuhui et al. “Ligation to Scavenging Strategy Enables On-Demand Termination of Targeted Protein Degradation.” Journal of the American Chemical Society vol. 145,13 (2023): 7218-7229. doi:10.1021/jacs.2c12809

       [3]Zhou, Li et al. “DNA framework-engineered chimeras platform enables selectively targeted protein degradation.” Nature communications vol. 14,1 4510. 27 Jul. 2023, doi:10.1038/s41467-023-40244-7

       [4]Zheng, Mengzhu et al. “Rational Design and Synthesis of Novel Dual PROTACs for Simultaneous Degradation of EGFR and PARP.” Journal of medicinal chemistry vol. 64,11 (2021): 7839-7852. doi:10.1021/acs.jmedchem.1c00649

       [5]Hollingsworth, S., Johnson, S., Khakbaz, P. et al. The rise of targeting chimeras (TACs): next-generation medicines that preempt cellular events. Med Chem Res 32, 1294–1314 (2023). https://doi.org/10.1007/s00044-023-03104-z

       [6]Zhan, Jiayin et al. “MicroRNA-Triggered Programmable DNA-Encoded Pre-PROTACs for Cell-Selective and Controlled Protein Degradation.” Angewandte Chemie (International ed. in English), e202415323. 9 Oct. 2024, doi:10.1002/anie.202415323