殼聚糖作為一種非病毒基因載體，由于具有良好的生物相容性、優(yōu)異的生物降解性、高陽(yáng)離子密度和低毒性等特點(diǎn)，被廣泛認為是一種理想的基因載體。研究發(fā)現，水溶液中殼聚糖能使磷脂雙層形成囊泡，直接破壞磷脂雙層疏水核心的結構，還能打開(kāi)上皮細胞間的緊密連接，便于大分子物質(zhì)通過(guò)上皮組織的運轉。不同相對分子質(zhì)量的殼聚糖/DNA復合物對細胞的轉染率一般比裸DNA、磷酸鈣法及聚L-賴(lài)氨酸/DNA復合物高，但比商品化的轉染試劑lipofectamine低。影響殼聚糖納米粒體內外轉染效果的因素有多種，主要和復合物顆粒大小、殼聚糖的相對分子質(zhì)量、殼聚糖和DNA的N/P比（殼聚糖的氨基和DNA的磷酸基之比）、pH、血清的濃度及殼聚糖的脫乙酰度等因素有關(guān)。復合物顆粒大小直接影響在體內運輸和向靶細胞進(jìn)入，從而影響基因的轉染率。研究認為，15 kDa和52 kDa的殼聚糖聚合物能極大地提高熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)對人肺癌A549細胞的轉染率，相對分子質(zhì)量大于100 kDa的轉染率比它們低，而七聚物(1.3kDa)沒(méi)有熒光素酶表達。此外，殼聚糖的脫乙酰度也是一種重要因素，因為它影響DNA的結合、釋放和基因在體內外的轉染率。脫乙酰度降低，DNA和殼聚糖的結合率降低，要形成完全的DNA復合物必須要有更高的N/P比。殼聚糖作為基因遞送載體，不同條件下對DNA的釋放有較大的影響，研究報道，在肝磷脂存在下高分子殼聚糖保持穩定，而在聚合度為18的殼聚糖和肝磷脂共同保溫條件下，可降解并釋放DNA，釋放的DNA幾乎保持完全的超螺旋，平均聚合度為18的殼聚糖在高電荷比條件下和DNA能形成穩定復合物，而且效率較高。

       殼聚糖衍生物作為基因載體的研究

       為了提高殼聚糖/DNA復合物的轉染率以使其更具有靶向性，人們對殼聚糖進(jìn)行了修飾。

       ①半乳糖基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇(G-CP)。

       研究報道，將半乳糖基和殼聚糖相連能使其對肝細胞具有靶向性，但缺點(diǎn)是轉染率很低。用半乳糖基低分子殼聚糖(Gal-LMWC)作為載體，結果表明，轉染率隨N/P比值的增大而增大，比值為5.6：1時(shí)達到最大值，因為半乳糖基密度增大時(shí)，復合物更容易和細胞表面的受體相互作用，從而提高轉染率。Gal-LMWC/DNA對HepG2細胞的轉染率比HeLa細胞高，表明基因對肝細胞的轉染是通過(guò)受體介導的細胞內吞途徑。和其他載體相比，GAL-LMWC/DNA在HepG2細胞中的轉染率比裸DNA、CaP/DNA、HMWC/DNA、LMWC/DNA高，而比lipofectamine/DNA低。

       ②季銨化殼聚糖。

       首先利用殼聚糖寡聚物(<20個(gè)單體)合成三甲基殼聚糖(TMO)，再用季銨化為40%(TMO-40)和50%(TMO-50)分別和質(zhì)粒DNA形成復合物，以DOTAP(一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉染試劑)相對照，對COS-1細胞的轉染結果為：DOTAP/DNA比裸DNA的轉染率高；殼聚糖寡聚物的轉染率是裸DNA的2～4倍；TMO-40/DNA顯示比TMO-50/DNA高的轉染率，配比為6:1和14:1時(shí)比裸DNA分別提高26倍和131倍。在10%的胎牛血清的培養基中DOTAP/DNA復合物的轉染率顯著(zhù)降低，而對TMO/DNA復合物的影響不大，對TMO-40的影響小于對TMO-50的影響。殼聚糖和三甲殼聚糖與DOTA相比無(wú)細胞毒性，而DOTAP使細胞活性降低50%。TMO/DNA復合物對HepG2細胞有特異的靶向性，可能通過(guò)復合物和細胞表面的半乳糖受體相互作用。

       ③殼聚糖/DNA-配體復合物。

       向殼聚糖/DNA復合物引入針對特定細胞表面受體的配體是提高轉染率的又一方法。比如轉鐵蛋白受體，這一系統基于轉鐵蛋白受體介導的細胞內吞作用將外源基因轉入細胞而得到比較高的轉染率，不同細胞系轉染率不同。

       ④烷基化殼聚糖。

       首先制得十二烷基殼聚糖，與DNA通過(guò)靜電相互作用形成復合物。由于十二烷基殼聚糖的保護作用，DNA分子熱穩定性提高。DNA酶解實(shí)驗表明，原始DNA酶解成碎片，而被十二烷基殼聚糖保護的DNA保持完好。

       ⑤脫氧膽酸改性的殼聚糖(DAMC)。

       脫氧膽酸是膽汁酸的主要成分，由于膽汁酸可在水中自締合，所以脫氧膽酸改性的殼聚糖也可自聚集形成平均直徑為160 nm的膠囊。當N/P比為4:1時(shí)殼聚糖自聚體與質(zhì)粒DNA間即可形成復合物，粒徑在130～300 nm之間。以脫氧膽酸殼聚糖介導質(zhì)粒DNA對COS-1細胞(猴腎細胞)的轉染率高于裸DNA，但低于lipofectamine試劑。

       ⑥咪唑烯酸修飾的殼聚糖。

       咪唑丙烯酸(uA)和可溶性殼聚糖通過(guò)酯化反應得到咪唑丙烯酸修飾的殼聚糖(UAC)，N/P比在5～30之間的復合物DNA可抵抗脫氧核糖核酸酶I(DnaseI)降解而得到很好的保護。UAC/DNA復合物平均直徑小于100 nm，生理條件下復合物顆粒變大。但在高N/P值下，可形成150 nm左右的顆粒而滿(mǎn)足要求。N/P增大，zeta電位升高，比值大約為3時(shí)，可完全屏蔽DNA的負電荷，uA在UAC中含量增高，zeta電位增高。UAC對293T細胞(人腎上皮細胞系的一種)的生存能力沒(méi)有影響，且uA含量增加，細胞的生存能力提高，UAC對其它細胞的毒性也可忽略。對293T細胞的轉染率隨N/P比的增大而升高，復合物的轉染率隨著(zhù)uA取代的增加顯著(zhù)升高，但UAC/DNA復合物對HeLa細胞和MCF-7細胞的轉染率沒(méi)有升高，對NCTC3749細胞只有微弱的升高，表明該殼聚糖/DNA對細胞的轉染有細胞特異性。

       ⑦兩性聚乙二醇殼聚糖。

       乙二醇殼聚糖經(jīng)酸解得到不同相對分子質(zhì)量的聚合物，再結合十六烷?；?，其中一些附加N-甲基季銨基聚合度為22時(shí)，N/P比為2:1或更高時(shí)，DNA和載體能完全結合，粒徑為200～500 nm。含有N-甲基季銨基的載體，其濃度為10 mg/ml時(shí)也沒(méi)有溶血性。乙二醇殼聚糖由于降解及十六烷?；囊攵a(chǎn)生細胞毒性，由于N-甲基的引入而恢復其生物相容性。降解的乙二醇殼聚糖/DNA復合物的轉染率僅在A(yíng)431細胞系(上皮癌細胞)中比陽(yáng)離子脂質(zhì)體高，但有N-甲基季銨離子的復合物在A(yíng)431和A549(肺腺癌細胞)細胞系中都高于陽(yáng)離子脂質(zhì)體。聚合度在73～171范圍內有轉染發(fā)生，聚合度再高則會(huì )影響復合物和細胞的結合，從而嚴重影響轉染率。用含有N-甲基季銨離子的載體體內試驗，最佳聚合度為86，在肝臟和心臟的基因表達水平都優(yōu)于Exgen500(線(xiàn)性聚乙胺)和Superfect(一種陽(yáng)離子聚合物，已經(jīng)商品化)。

       殼聚糖在基因治療中的應用

       近年來(lái)，殼聚糖及其衍生物作為核酸的非病毒載體受到了廣泛的關(guān)注。殼聚糖可以通過(guò)分子主鏈中帶正電的伯胺與DNA/RNA中帶負電的磷酸基團之間的靜電相互作用與核酸分子形成穩定的復合物。殼聚糖作為核酸遞送載體，不僅可以保護治療基因免受生理液體中內切酶的降解，還能延長(cháng)核酸分子的半衰期，從而提高轉染效率。

       ①遞送DNA

       殼聚糖被廣泛用作DNA的遞送載體。研究報道了一種用于DNA遞送的核-殼結構三元復合物體系。該體系使用線(xiàn)性聚乙烯亞胺偶聯(lián)解聚殼聚糖作為DNA包封核心，PEG和細胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPPs，序列為5~30個(gè)氨基酸)作為DNA包封外殼。該復合物通過(guò)帶負電的殼層和帶正電的核層之間的靜電相互作用形成，展現出良好的單分散性，其平均粒徑為120 nm，膠體穩定性好。通過(guò)在體外和體內實(shí)驗對三元復合物進(jìn)行了評估，結果顯示該復合物具有較好核酸負載能力、細胞攝取能力及核酸轉染效果。然而，該系統與核酸的相互作用不足，核酸遞送的效率不佳。為了解決這一問(wèn)題，有研究將殼聚糖引入聚乳酸-聚乙二醇(polylactic acid-polyethylene glycol，PLA-PEG)納米粒子中，旨在提高DNA在納米粒子中的包封效率，并增強對DNA酶解損傷的保護。實(shí)驗結果顯示，納米粒子的生物相容性顯著(zhù)提高，DNA的釋放得到改善，并且在乳腺癌MCF-7細胞中的基因轉染能力顯著(zhù)增強，表明通過(guò)殼聚糖、PLA和PEG的協(xié)同作用，可實(shí)現這一目標。

       ②遞送RNA

       用于治療應用的調節性非編碼RNA分子可分為siRNA、微RNA(micro RNA，miRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)和反義RNA。這些分子容易被人血清中的核酸酶降解，導致生物利用度較低，并且無(wú)法通過(guò)帶負電荷的細胞膜，單獨使用受到極大的限制。殼聚糖的生物相容性及其陽(yáng)離子性質(zhì)使其成為RNA遞送的潛在非病毒載體。研究人員針對殼聚糖的特定參數如分子質(zhì)量、脫乙?；潭群偷谆鶊F比，對RNA轉染能力進(jìn)行了深入研究，以提高殼聚糖基多聚物的RNA遞送效率。為了進(jìn)一步提升RNA的遞送效率，研究人員通過(guò)化學(xué)修飾以及在殼聚糖上接枝多肽或聚合物的方式，增強復合物的細胞穿透能力。其中，合成或天然的細胞穿透肽(如組氨酸、TAT、TAT-trans、CGKRK、精氨酸、聚L-精氨酸和魚(yú)精蛋白)的引入，不僅提升復合物穿透細胞膜的能力，還提升了復合物的穩定性，更有效地保護RNA免受血清蛋白酶的降解。結果顯示，這類(lèi)修飾顯著(zhù)增強了細胞對復合物的攝取，同時(shí)顯著(zhù)提高了核酸轉染和基因沉默能力。

       ③遞送CRISPR/Cas9

       CRISPR/Cas9是一種新興的基因編輯技術(shù)，已逐漸被研究者所認可，并在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應用，如鑒定疾病靶點(diǎn)、構建細胞系模型、開(kāi)發(fā)轉基因動(dòng)植物等。與此同時(shí)，人們正在探索其作為腫瘤治療基因編輯工具的潛力。CRISPR/Cas9是由核酸酶Cas9蛋白和單個(gè)引導RNA組成的大分子復合物。無(wú)論是通過(guò)mRNA和單導RNA在細胞內遞送合成表達核酸酶蛋白，還是直接遞送CRISPR/Cas9核糖核蛋白，都需要合適的遞送載體。雖然病毒載體以其高傳遞效率而聞名，但它們也存在固有缺點(diǎn)，如潛在的致癌風(fēng)險、插入大小的限制以及大規模生產(chǎn)的挑戰，這些都極大地限制了它們在CRISPR/Cas9傳遞中的應用。相比之下，殼聚糖具有更大的有效載荷，可以更有效地遞送CRISPR/Cas9基因編輯工具。通過(guò)修飾富含殼聚糖的官能團，可以提高遞送的靶向性，并有效保護細胞中的核酸酶蛋白。研究報道了一種包裹紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的殼聚糖載體。該載體具有高負載能力，可以將Cas9 RNP(一種帶有聚谷氨酸肽標簽的工程蛋白)和DNA供體遞送到特定細胞進(jìn)行基因編輯，還有研究開(kāi)發(fā)了一種功能化反應性殼聚糖載體，可遞送sgVEGFR2/Cas9質(zhì)粒和紫杉醇用于肝癌治療。

       參考資料

       [1]李華安,李志揚,林博涵,等.殼聚糖作為核酸遞送載體在基因治療中的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2025,34(07):713-719.

       [2]趙雪,任慧霞.殼聚糖及其衍生物作為基因遞送載體的研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2006,(02):1-5.

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I養食品的開(kāi)發(fā)與研究。