人類(lèi)諾如病毒（Human norovirus，HuNoV），也被稱(chēng)為諾瓦克病毒，是全球急性胃腸炎的主要原因之一。HuNoV影響所有年齡組，具有高度傳染性，特別是免疫系統較弱的人群，并可能導致嚴重的臨床后果。由于 HuNoV 具有遺傳變異大、進(jìn)化快的特點(diǎn)，這給抗病毒藥物的研發(fā)造成了極大挑戰。在全球范圍內，大多數胃腸炎病例是由大流行性 GII.4 人類(lèi)諾如病毒（HuNoV）毒株引起的。據估計，諾如病毒每年導致約 6.84 億人患病，約 21.2 萬(wàn)人死亡。衛生系統和社會(huì )直接成本每年超過(guò)600 億美元。作為一種傳染性極強的腸道病原體，其對全球公共衛生造成重大威脅，引起了國際上的廣泛關(guān)注。目前，還沒(méi)有批準的疫苗和針對 HuNoV 的特異性治療方法。

       諾如病毒（Norovirus，NoV）是無(wú)包膜的單股正鏈 RNA 病毒。HuNoV的RNA 基因組長(cháng)約 7.7 kb，其基因組由三個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）組成：ORF1 編碼一個(gè)多聚蛋白，該蛋白被病毒蛋白酶裂解為六個(gè)非結構蛋白，其中包括 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶（RdRp），這是一種促進(jìn)病毒 RNA 復制的關(guān)鍵酶；ORF2 編碼主要衣殼蛋白 VP1，該蛋白結構上分為S和 P區兩個(gè)相鄰的區域，其中 S區形成內核，構成 VP1 的底座；P 區形成拱樣結構突出于內核外，可進(jìn)一步分為 P1和P2亞結構域；ORF3 編碼次要衣殼蛋白VP2，VP2具有穩定病毒顆粒的作用。根據VP1 的氨基酸序列，NoV 被分類(lèi)為至少10個(gè)基因組（GI-GX），這些基因組進(jìn)一步細分為49個(gè)基因型。在可感染人類(lèi)的五種基因組（GI、GII、GIV、GVIII和GIX）中，GI 和GII 突變體是導致腸胃炎病例的主要病原體。特別是 GII.4 基因型長(cháng)期以來(lái)一直是全球胃腸炎暴發(fā)的主要原因，其變體每隔 2-4 年就會(huì )進(jìn)化成新的變體，因其高傳染性和引發(fā)大規模流行病的能力而聞名。

       NoV基因組測序有助于開(kāi)發(fā)基于核酸的NoV 檢測方法。20世紀90年代中期，第一個(gè)以 ORF1 中RNA 聚合酶基因相對保守區為靶點(diǎn)的 RT-PCR 被用于檢測 NoV。此后，針對 NoV開(kāi)發(fā)了更多實(shí)時(shí)、快速和靈敏的分子檢測方法，包括 RT-qPCR、微滴數字 RT-PCR、多重 RT-PCR、巢式 PCR、高通量測序基因芯片、逆轉錄環(huán)介導等溫擴增法等。通過(guò)靶向檢測ORF1-ORF2 連接處的保守基因組區域，發(fā)現基于實(shí)時(shí)核酸的方法比抗原檢測分析更靈敏、更具廣泛的反應性。普通 RT-PCR 在電泳過(guò)程中易交叉污染。多重 RT-PCR 雖然具有同時(shí)檢測多種目標分子的優(yōu)點(diǎn)，但容易發(fā)生非特異性擴增。巢式 PCR 無(wú)法對病毒定量，耗時(shí)長(cháng)且容易發(fā)生交叉污染。近年來(lái)，普通 RT-PCR、多重 RT-PCR 等逐步被新方法取代。

       諾如病毒小分子抑制劑

       人類(lèi)諾如病毒抗病毒藥物早期研究的進(jìn)展緩慢，很大程度上是由于其細胞培養系統的建立困難。直到2016 年，人類(lèi)諾如病毒在源自干細胞的人腸上皮細胞（human intestinal enteroids, HIEs）中的培養系統才初步建立，但 HIEs 系統中的病毒復制量?jì)H為670倍，其有限的病毒復制量仍是研究疫苗和藥物的障礙（諾如病毒在B細胞系中的復制量更低）。此外，人類(lèi)諾如病毒具有物種特異性，無(wú)法感染其他物種。此前對人類(lèi)諾如病毒的認知主要基于其他杯狀病毒研究，例如通過(guò)鼠諾如病毒在細胞培養和小鼠模型中篩選潛在抗病毒藥物。在腸道類(lèi)器官培養模型中篩選諾如病毒抑制劑成為開(kāi)發(fā)慢性感染治療的新策略，許多廣譜抗病毒藥物已在實(shí)驗中表現出對諾如病毒的抑制活性。

       1、RNA 聚合酶抑制劑

       HuNoV的RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）在病毒基因組的轉錄和復制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，成為抗病毒治療的重要靶點(diǎn)。RdRp是一種用于病毒復制的酶，在RNA 病毒中高度保守，且在哺乳動(dòng)物細胞中無(wú)同源蛋白，是抗病毒藥物研究的重要靶點(diǎn)。HuNoV 的RdRp 結構類(lèi)似于其他正鏈 RNA 病毒，具有右手型結構，包括手指、手掌和拇指子結構域，以及連接手指和拇指的 N端結構域。手指和拇指子結構域協(xié)作包圍手狀結構，形成單鏈模板 RNA 的通道。

       ①核苷類(lèi)抑制劑

       RNA依賴(lài)性RNA 聚合酶（RdRp）是治療諾如病毒感染的重要靶點(diǎn)。核苷類(lèi)抑制劑（nucleoside inhibitors, NIs）作為底物類(lèi)似物，通過(guò)競爭性抑制終止 RNA 合成，通常表現出廣譜抗病毒活性。目前發(fā)現，針對其他 RNA 病毒開(kāi)發(fā)的核苷抑制劑也可用于諾如病毒感染治療。

       法匹拉韋（favipiravir, T-705）是一種前藥，在體內快速轉化為法匹拉韋三磷酸，通過(guò)競爭性抑制病毒復制轉錄并誘發(fā)致命突變。該藥物已在部分國家廣泛用于流感治療，并在埃博拉病毒、COVID-19及拉沙熱的治療中發(fā)揮作用。法匹拉韋作為嘌呤類(lèi)似物，可抑制人類(lèi)諾如病毒復制子。實(shí)驗表明其對鼠諾如病毒具有療效，在小鼠模型中通過(guò)抗病毒誘變降低病毒載量，并觀(guān)察到突變頻率增加及病毒 RNA 傳染性降低。然而，法匹拉韋可能在小鼠和患者體內誘導誘變，用于慢性諾如病毒感染存在潛在風(fēng)險。

       利巴韋林（ribavirin）是廣譜抗病毒藥物，對DNA和RNA病毒均有效，臨床用于呼吸道合胞病毒、流感、拉沙熱、肝炎及麻疹治療。利巴韋林通過(guò)抑制RdRp發(fā)揮作用，對鼠諾如病毒抑制效果顯著(zhù)，是當前治療諾如病毒感染的主要藥物，尤其在原發(fā)性免疫缺陷患者的慢性感染中療效顯著(zhù)。但其與硝唑尼特聯(lián)用效果存在爭議，部分臨床數據顯示療效欠佳

       2′-FdC（2′-fluoro-2′-deoxycytidine）是核苷類(lèi)似物，其通過(guò)轉化為 2′-FdC-三磷酸（FdCTP）并入細胞 DNA/RNA，抑制病毒復制，對HCV、拉沙病毒及克里米亞-剛果出血熱病毒等均有效。研究發(fā)現，在RAW264.7小鼠巨噬細胞模型中，2′-FdC 能有效抑制鼠諾如病毒傳播。能夠顯著(zhù)降低 RAW264.7 細胞中 MNV-1 的病毒RNA和NS1/2 蛋白表達。使用 100 μmol·L-1的 2′-FdC 處理后，諾如病毒滴度降低，其抑制 MNV-1 復制的 IC50 值為 20.92 μmol·L-1，RAW264.7 細胞中 2′-FdC 的CC50 值為 1.768 mmol·L-1。為進(jìn)一步驗證 2′-FdC 的功效，研究人員測試了急性清除菌株 MNVCW3 和持續性菌株 MNVCR6，結果顯示 2′-FdC 同樣能抑制兩種病毒株的 RNA 復制及蛋白表達。

       2′-C-甲基胞苷（2′-C-methylcytidine, 2CMC）最初作為抗 HCV 藥物開(kāi)發(fā)，但其前藥 Valopicitabine 因胃腸道副作用終止臨床研究。然而，2CMC仍被報道為潛在抗諾如病毒藥物。研究表明，2CMC 可抑制鼠諾如病毒形成及RNA合成，并在小鼠模型中減少病毒脫落及傳播。在人類(lèi)諾如病毒 BJAB 細胞培養系統中，2CMC的EC50值為0.3 μmol·L-1。研究人員評估了2CMC衍生物，如2FCMC、N-羥基胞苷NHC的活性。在 RAW264.7 細胞中，2CMC 和2FCMC 的EC50 分別為 6.9 μmol·L-1和 12.7 μmol·L-1，而 NHC 和拉米夫定無(wú)顯著(zhù)抑制。在 HG23 細胞中，2CMC、NHC和2FCMC的EC50分別為1.3 μmol·L-1、1.5 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1。目前研究聚焦于開(kāi)發(fā)更安全的 2CMC 衍生物。

       4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪核苷衍生物具有顯著(zhù)抗諾如病毒活性。其通過(guò)修飾糖基和堿基獲得系列衍生物，其EC50為0.007~11 μmol·L-1，CC50 為0.01~23.7 μmol·L-1。盡管存在細胞毒性，但其雙重抗小鼠和人類(lèi)諾如病毒活性為后續優(yōu)化提供了基礎。

       NCT（5-硝基胞苷三磷酸）最初作為抗脊髓灰質(zhì)炎病毒藥物被發(fā)現，其抑制 RdRp活性?xún)?yōu)于利巴韋林。過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)測定了諾如病毒聚合酶與NCT結合的高分辨率結構。該結構顯示，RdRp被包裹在一個(gè)包含互補引物模板RNA和兩個(gè)金屬離子的三元復合物中。NCT分子占據核苷酸結合位點(diǎn)，通過(guò)競爭性抑制導致RNA鏈終止，但其抑制諾瓦克病毒復制的潛力仍需更多實(shí)驗驗證。

       ②非核苷類(lèi)抑制劑

       非核苷類(lèi)抑制劑（non-nucleoside inhibitors, NNIs）通過(guò)與RdRp變構位點(diǎn)結合，終止復制所需的構象變化。目前NNIs主要針對HCV或HIV開(kāi)發(fā)，尚無(wú)專(zhuān)門(mén)針對人類(lèi)諾如病毒的上市藥物。

       蘇拉明（suramin）通過(guò)脂質(zhì)體遞送可抑制鼠諾如病毒復制，但其臨床應用受限于藥代動(dòng)力學(xué)和毒性問(wèn)題。其衍生物PPNDS最初作為P2X1受體激動(dòng)劑，后證實(shí)對人諾如病毒和MNV RdRp具有強效抑制。PPNDS通過(guò)結合RdRp的NAF2位點(diǎn)廣泛抑制轉錄活性。在10 μmol·L-1濃度下，PPNDS對貓諾如病毒聚合酶的IC50達2.7 μmol·L-1。然而，蘇拉明及PPNDS因細胞通透性差和非特異性脫靶活性，需進(jìn)一步優(yōu)化以克服研發(fā)障礙。

       近年研究發(fā)現，HCV NNIs如JTK-109可通過(guò)結合Thumb I位點(diǎn)（Q414和R419）抑制杯狀病毒科，如諾如病毒屬、沙波病毒屬和拉戈病毒屬等6個(gè)RdRp的轉錄活性，其抑制諾如病毒RdRp的IC50為4.3~16.6 μmol·L-1。

       NIC02、NIC04、NIC10和NIC12化合物也是潛在的藥物支架。通過(guò)GTP摻入法動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現，NIC02和NIC04可同時(shí)結合游離酶及酶-底物復合物。而NIC10和NIC12只與酶-底物復合物結合，因此可能與底物結合位點(diǎn)不同的變構口袋結合，所以NIC02和NIC04、NIC10和NIC12在諾如病毒RdRp中可能占據不同的結合位點(diǎn)。

       2、3C樣蛋白酶抑制劑

       諾如病毒3C樣蛋白酶（3CLpro）是一種半胱氨酸蛋白酶，其核心結構與胰凝乳蛋白酶類(lèi)似，由N端反平行β折疊和C端β桶結構域組成?；钚晕稽c(diǎn)位于兩結構域間裂口處，催化三聯(lián)體（Cys139、His30、Glu54）特異性識別P1 Gln殘基，負責病毒多蛋白裂解，生成結構與非結構蛋白。因此，3CLpro是抗諾如病毒藥物設計的重要靶點(diǎn)。

       蘆平曲韋（rupintrivir）最初針對人類(lèi)鼻病毒3CLpro開(kāi)發(fā)，近期研究顯示其可抑制人類(lèi)諾如病毒3CLpro，EC50為（0.3 ± 0.1）μmol·L-1，EC90為（1.5 ± 0.2）μmol·L-1。但A105V和I109V突變可降低病毒對蘆平曲韋的敏感性，耐藥機制尚不明確。

       GC376 等一系列 3CLpro 過(guò)渡態(tài)抑制劑。過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物競爭性抑制劑在分子結構上與底物相似，在酶促反應中，抑制劑和底物競爭與酶的活性中心結合。過(guò)渡態(tài)抑制劑目前可分為兩類(lèi)，一類(lèi)是肽基化合物（如 GC376），研究人員利用諾如病毒蛋白酶在谷氨酰胺-甘氨酸肽位點(diǎn)裂解的特點(diǎn)，通過(guò)谷氨酰胺替代物發(fā)揮抑制作用?；诖私Y構開(kāi)發(fā)的一系列變體均顯示出高水平抗病毒活性。另一類(lèi)是大環(huán)化合物，作為肽基抑制劑的結構修飾版本，旨在提高膜透性和口服生物利用度以增強臨床適用性。盡管其效果不及肽基抑制劑，但表現出對 RNA 病毒的廣譜抗病毒活性。

       3、未知作用靶點(diǎn)藥物

       硝唑尼特（nitazoxanide, NTZ）最初作為抗寄生蟲(chóng)藥物開(kāi)發(fā)，后證實(shí)具有廣譜抗病毒活性，臨床用于流感及諾如病毒感染治療。硝唑尼特作為新型藥物的支架參與病毒復制的宿主調節過(guò)程。硝唑尼特生物利用度高且十分安全，具有豐富的上市后經(jīng)驗，超過(guò)7500萬(wàn)成人和兒童服用過(guò)此藥物。而目前有多項臨床實(shí)驗表明，硝唑尼特對于治療諾如病毒感染具有顯著(zhù)療效。目前，其新型制劑正在進(jìn)行全球III期臨床試驗，可抑制輪狀病毒、冠狀病毒、登革熱病毒等多種RNA/DNA病毒。

       參考資料

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       [3]孫睿陽(yáng),劉永祥,鐘武.小分子諾如病毒抑制劑的研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報,2023,40(12):1656-1665.

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I養食品的開(kāi)發(fā)與研究。