微生物發(fā)酵項目放大需經(jīng)過(guò)小試、中試到大生產(chǎn)的過(guò)程。其中搖瓶前規模為小試，以發(fā)酵罐到更大規模發(fā)酵罐為中試。中試放大一是可以探索實(shí)驗室的新菌種的生產(chǎn)效能，探索之前確定的發(fā)酵環(huán)境的適配性與在優(yōu)化，包括發(fā)酵培養基配方和工藝條件；中試放大二是可以對生產(chǎn)上發(fā)現的問(wèn)題進(jìn)行小規模再研究，可降低糾錯成本，中試放大是小試實(shí)驗研究到工業(yè)化生產(chǎn)的過(guò)渡，也是微生物發(fā)酵項目成功的必需，而其中上發(fā)酵罐又是這過(guò)程的關(guān)鍵一步，因為從搖瓶到發(fā)酵不僅僅是量的變化，更是增加反饋與控制的第一次質(zhì)變。
曾經(jīng)有人包括合成生物學(xué)的博士咨詢(xún)筆者，小試發(fā)酵如何設置發(fā)酵罐并開(kāi)始發(fā)酵呢？個(gè)人回答一般的方法論是，參照搖瓶或者一般知識確定起始參數開(kāi)啟發(fā)酵，再結合罐上的具體情況科學(xué)調整逐步優(yōu)化。
第一步，通過(guò)說(shuō)明書(shū)或者與廠(chǎng)家工程師交流熟悉發(fā)酵罐。國內的品牌有國強、百侖、保興等的，其硬件與軟件都不一樣，僅僅是使用的話(huà)熟悉起來(lái)也很容易。按照攪拌系統、溫控系統、補料系統與供排氣系統等幾個(gè)系統去了解，pH、溶解氧等電極按照說(shuō)明書(shū)標定，補料的泵速按照說(shuō)明書(shū)用天平與水來(lái)標定。需要注意的是，小型發(fā)酵罐啟用前可能是直接放入滅菌鍋里滅菌的，所以滅菌時(shí)需要斷開(kāi)一切的反饋與控制的連接，而在滅菌完成后開(kāi)始發(fā)酵前又要及時(shí)與控制柜做好各系統的連接。
第二步，通過(guò)搖瓶或者一般知識確定起始參數。
① 我們把發(fā)酵罐的基礎料體積除以發(fā)酵罐的總體積的得數叫裝料系數，這個(gè)系數因攪拌大小、泡沫大小及罐本身的設計與大小而有所不同，一般地剛開(kāi)始上罐時(shí)可以定在40-60%，比如5L的罐基礎料可以是2L到3L；
② 先可以直接采用搖瓶發(fā)酵時(shí)的培養基配方，或者通用的網(wǎng)絡(luò )可查的各類(lèi)菌對應的通用配方。按照罐的控制系統補料泵個(gè)數，考慮幾路控制補料。消泡劑控制發(fā)酵過(guò)程中可能的起泡，這個(gè)的反饋與控制可利用罐上的泡沫感應器自動(dòng)控制；酵母控制pH可采用液堿，大腸桿菌控制pH可采用氨水，這個(gè)的反饋與控制可利用罐上的pH計自動(dòng)控制；補充氮源來(lái)生產(chǎn)蛋白或者補充碳源來(lái)生產(chǎn)其他產(chǎn)物，這個(gè)也可自動(dòng)控制，只是因牽涉到整個(gè)工藝調整，后續再展開(kāi)；
③ 我們把多少通風(fēng)量L/min除以料液體積L的得數叫vvm，這個(gè)系數因菌種對氧的需要及罐本身的設計而有所不同，小罐試驗時(shí)可初定比較高一點(diǎn)的，比如酵母1，大腸桿菌1.5，再按照基礎料體積計算后先不變動(dòng)；
④ 攪拌轉速，一般建議根據搖瓶而來(lái)起始設定為200rpm，隨著(zhù)菌體的生長(cháng)，之后設定溶解氧在30%左右時(shí)關(guān)聯(lián)攪拌提速，也可手動(dòng)逐步提速。酵母8h前延滯期內，大腸桿菌4h前的延滯期內溶氧下降緩慢而攪拌轉速可不提升，經(jīng)過(guò)對數生長(cháng)期時(shí)是攪拌逐步提升的過(guò)程，酵母16h左右到400rpm，大腸桿菌8h左右到600rpm。
第三步，結合罐上的具體情況科學(xué)調整逐步優(yōu)化。即使前幾批主要是與設備磨合的一些調整，其實(shí)發(fā)酵已經(jīng)開(kāi)始，而你也開(kāi)始涉及到發(fā)酵工藝調整了。
① 如果延滯期過(guò)長(cháng)，或者平臺期的OD600較低?？蓮奶嵘臃N量、優(yōu)化培養基碳氮比，增加微量元素等措施試試改善。
② 如果補料過(guò)多，或者發(fā)酵罐體積過(guò)大?？蓮南抡{基礎料體積，降低補料速度或者提升補料濃度等措施試試改善。
因為發(fā)酵罐補料使營(yíng)養比搖瓶豐富，高轉速下傳質(zhì)傳熱比搖瓶好，其控制的維度也比搖瓶多，量變到質(zhì)變，故此認為與搖瓶相比發(fā)酵罐是一次質(zhì)的飛躍，發(fā)酵罐有比搖瓶復雜得多的內容。
真正要做到持續穩定發(fā)酵，需要有微生物知識與無(wú)菌操作作為前提，有對物料、設備、自動(dòng)化控制的理解及一定的檢測分析能力作為解決異常的保障，還要有系統化的分析思維，因為在發(fā)酵過(guò)程中各參數是相關(guān)關(guān)聯(lián)的，一個(gè)結果對應的原因是多方面的，有時(shí)甚至是反向的，比如pH突然上升是罐壓下降或者堿液泵自控異常、發(fā)酵液染菌異常還是缺糖；比如泡沫異常時(shí)，是補料不夠缺營(yíng)養，還是補料過(guò)多生長(cháng)過(guò)快導致自溶等等，需要經(jīng)過(guò)多手段確認后再去調控方可保證發(fā)酵持續穩定，這些在后續再展開(kāi)。今天你已經(jīng)開(kāi)始使用發(fā)酵罐了。
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