隨著(zhù)生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展及競爭加劇，縮短藥品開(kāi)發(fā)周期，開(kāi)發(fā)高效、穩健和高質(zhì)量的生產(chǎn)工藝并降低生產(chǎn)成本顯得尤為迫切。目前大部分企業(yè)使用高通量技術(shù)、平臺工藝以及一次性生產(chǎn)技術(shù)等來(lái)加速產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。其中高通量技術(shù)可同時(shí)開(kāi)展多組實(shí)驗進(jìn)行實(shí)驗設計(DOE)，可縮短工藝開(kāi)發(fā)時(shí)間且能夠得到較好的實(shí)驗效果。高通量微型反應器的種類(lèi)繁多，早期的產(chǎn)品如微孔板、24深孔板，其體積量在微升級別，多用于原始克隆篩選，但是因無(wú)法對細胞培養過(guò)程中重要參數監控，導致使用范圍受限，并逐漸被淘汰。目前應用廣泛的3種高通量微型生物反應器分別是 Simcell、Ambr 15、Ambr 250，其培養體積規模各不相同，適用于不同的細胞培養工藝開(kāi)發(fā)階段。

       SimCell微型反應器系統包括5個(gè)培養室，每個(gè)培養室含有42個(gè)卡式微型反應器模塊，每個(gè)模塊有6個(gè)總體積<800μL獨立控制的微型反應器(培養體積為300-700 μL) ，一臺SimCell系統理論上最多可同時(shí)運行1260個(gè)微型反應器。每個(gè)培養室可獨立控制溫度、相對濕度及通氣量，可在線(xiàn)測量細胞密度、pH及溶氧（DO）等參數。SimCell微型反應器可用于克隆篩選及早期工藝優(yōu)化。SimCell系統的顯著(zhù)優(yōu)勢為超高通量和超微體積，但小體積無(wú)法滿(mǎn)足常規離線(xiàn)分析需求，且無(wú)攪拌槳，不能很好地擬合大規模反應器。

       Ambr 系統由一次性反應器罐體、自動(dòng)化工作站及操作軟件3部分組成，包括Ambr 15 和 Ambr 250。Ambr 系統具有高通量、自動(dòng)化及體積小等優(yōu)勢，且罐體幾何學(xué)設計如高徑比、槳葉設計等均與經(jīng)典攪拌反應器類(lèi)似，可實(shí)時(shí)監測和控制工藝過(guò)程中的各個(gè)參數，具有良好的平行性與放大性。Ambr 系統軟件具備較高效的數據記錄、管理和分析能力，可以在工藝開(kāi)發(fā)和晚期臨床階段執行 DOE 和數據分析。目前 Ambr 系統在生物制藥行業(yè)中得到了較為廣泛的應用。Ambr 15工作體積為10～15mL，一次可運行24～48個(gè)生物反應器，具有攪拌槳和獨立通氣管路。除溫度和轉速由工作站統一控制外，其他參數如pH 及 DO 均可獨立控制?；诟叨茸詣?dòng)化的機械臂，Ambr 15 系統可自動(dòng)完成取樣及補液操作。由于A(yíng)mbr 15 系統培養體積較小，限制了培養過(guò)程中的取樣頻率和收獲體積，無(wú)法為下游純化及制劑分析提供足夠多的樣品。此外，細胞培養過(guò)程中取樣、補料及補堿等操作可能會(huì )引起Ambr 15系統在線(xiàn) DO、pH及溫度的波動(dòng)。

       Ambr250是Ambr 15 的升級產(chǎn)品，能獨立運行12～24個(gè)一次性生物反應器，工作體積為100-250mL，可滿(mǎn)足后續純化和樣品分析需求，可獨立控制溫度和轉速，有4條補料管路連接每個(gè)反應器，可實(shí)現分批補料(10μL～10mL) 或連續流加，實(shí)現細胞培養和微生物發(fā)酵不同工藝的需求。Ambr 250一次性反應器含有雙層斜三葉槳，嵌合4個(gè)擋板以促進(jìn)液體混合，與傳統生物反應器有類(lèi)似的幾何尺寸及流體力學(xué)性質(zhì)，從而保證 Ambr 250細胞培養的微環(huán)境在一定程度上與傳統反應器更接近，工藝容易放大。

       近年來(lái)，高通量微型生物反應器已在生物制藥行業(yè)得到廣泛應用，可應用于細胞株篩選、培養基與工藝開(kāi)發(fā)及工藝表征等各個(gè)階段。

       1、克隆篩選與培養基開(kāi)發(fā)

       細胞株篩選要先把目的基因整合到基因組中，而這個(gè)過(guò)程是隨機的，因此，轉染后的每個(gè)細胞表現各異，需進(jìn)行大量克隆篩選以得到最終的高產(chǎn)穩定細胞株。一般使用微孔板等進(jìn)行早期高通量克隆篩選，然后在24深孔板、搖管或搖瓶中補料分批培養進(jìn)行進(jìn)一步篩選。從24深孔板、搖管或搖瓶中篩選得到的表現較好的細胞株在放大至反應器時(shí)會(huì )出現不一致情況，這是由于部分高表達克隆不具備可放大性，另外這些培養容器不能監控pH 與 DO 等關(guān)鍵參數，培養微環(huán)境與臺式反應器相差甚遠，不能很好地預測高產(chǎn)克隆在反應器規模上的表現。傳統反應器由于通量低且運行成本高，評估的克隆數量有限，也不是理想的克隆篩選工具。為降低細胞株在工藝放大時(shí)出現異常風(fēng)險，可使用高通量 Ambr 系統進(jìn)行篩選評估，其具有較好的預測性和可放大性，是高效可靠的克隆篩選工具。此外，可通過(guò)整合的克隆篩選軟件進(jìn)行克隆篩選排序評分，為候選克隆的選擇提供指導。此外，培養基開(kāi)發(fā)是提高產(chǎn)量、質(zhì)量及降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵手段之一。高通量細胞培養設備可用于培養基的高通量快速篩選，優(yōu)化培養基的關(guān)鍵組分。

       2、工藝開(kāi)發(fā)

       使用Ambr 15 反應器同步運行24個(gè)實(shí)驗條件考察接種密度、pH及 DO 等3個(gè)關(guān)鍵工藝參數，結果顯示相同條件下的反應器在細胞生長(cháng)、代謝以及蛋白表達方面表現具有高度一致性，不同條件下的反應器則有明顯區別，大大提高了工藝優(yōu)化的效率。分別在搖瓶和Ambr 15 反應器中測試一種新開(kāi)發(fā)的培養基，結果發(fā)現Ambr 15 反應器中的細胞活率和蛋白產(chǎn)量相比于搖瓶均有明顯下降。經(jīng)過(guò)分析，Ambr 15反應器中蛋白產(chǎn)量和細胞活率的下降可能是由于乳酸濃度增加引起的。為了研究Ambr 15 反應器中乳酸濃度升高的原因，考察了轉速、通氣和pH 對乳酸積累的影響。結果顯示，通氣和pH 控制策略對乳酸積累有統計學(xué)意義上的影響，其中pH 影響顯著(zhù)。使用優(yōu)化后的條件在A(yíng)mbr 15 中運行，達到了與搖瓶培養一致的細胞活率和表達水平。高通量微型生物反應器中進(jìn)行的工藝優(yōu)化需放大至生產(chǎn)規模反應器中，因此評價(jià)設備和工藝的可放大性也尤為重要。研究發(fā)現，將在A(yíng)mbr 15 中開(kāi)發(fā)的細胞培養工藝分別放大至2L反應器和80L，400L Zeta 不銹鋼生物反應器，結果顯示 Ambr15 與不同規模的反應器在細胞生長(cháng)、代謝、蛋白表達及產(chǎn)品質(zhì)量屬性上均比較一致。這一結果顯示Ambr 15 反應器具備較好的可放大性。

       3、工藝表征

       細胞培養工藝表征的目的是研究關(guān)鍵操作參數與細胞培養關(guān)鍵性能指標如細胞生長(cháng)、產(chǎn)品表達及最終產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性等之間的關(guān)系，來(lái)確定各關(guān)鍵操作參數的可接受范圍，并證明工藝的穩健性。傳統上，一般使用1~10L規模的臺式反應器進(jìn)行大量的 DOE 實(shí)驗以評估各個(gè)參數的主效應及交互作用影響，這需要投入大量的時(shí)間、人力和資源。高通量 Ambr 系統作為縮小模型進(jìn)行工藝開(kāi)發(fā)和工藝表征已有不少研究。

       Ambr 系統可作為高效的縮小模型應用于工藝開(kāi)發(fā)與工藝表征，能顯著(zhù)加快工藝開(kāi)發(fā)和工藝表征過(guò)程。不過(guò) Ambr 系統作為商業(yè)化生產(chǎn)工藝的縮小模型來(lái)進(jìn)行工藝表征仍面臨一些挑戰。首先，縮小模型標準在 Ambr 和大規模生物反應器間是不可比的，需要對 Ambr 系統進(jìn)行更詳細更有針對性的表征研究，并采用新的縮小模型策略。其次，需要采用更合適的風(fēng)險評估及統計分析軟件來(lái)解決高通量實(shí)驗設計及數據分析的瓶頸。最后，需要認識到并非所有的工藝都可利用 Ambr 系統建立縮小模型，要充分了解設備的限制以及相關(guān)的關(guān)鍵操作參數及關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

       高通量微型生物反應器系統在早期工藝開(kāi)發(fā)階段可使用 DOE 實(shí)驗進(jìn)行高通量工藝研究，縮短工藝開(kāi)發(fā)時(shí)間并降低人力物力成本，加速晚期臨床階段工藝優(yōu)化與工藝表征，推進(jìn)生物藥物的快速發(fā)展。高通量微型反應器具有操作簡(jiǎn)單、通量高、成本縮減等優(yōu)勢，能夠較大程度提升工藝開(kāi)發(fā)的效率，降低研發(fā)成本和縮短研發(fā)周期。同時(shí)，這類(lèi)反應器可有效結合DOE 設計進(jìn)行工藝開(kāi)發(fā)，提高工藝穩定性和工藝質(zhì)量可控性，這也使得高通量微型反應器的應用前景更為廣闊。

       參考文獻：

       [1]姚小員,裴新,查鑫華,張磊,季宇.高通量微型生物反應器在生物制藥行業(yè)中的應用[J].中國新藥雜志,2021,30(22):2075-2082.

       [2]郭玉蕾,唐亮,孫瑞強,李尤,陳依軍.高通量微型生物反應器的研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2018,38(08):69-75.DOI:10.13523/j.cb.20180809.

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I養食品的開(kāi)發(fā)與研究。