高效液相色譜法（HPLC）是制藥行業(yè)分析檢測的主要手段，也是分析工作者首當其沖需要掌握的一門(mén)技術(shù)。隨著(zhù)2025藥典的發(fā)布與實(shí)施，液相檢測技術(shù)也迎來(lái)了新的挑戰。
2025年版《中國藥典》二部對110多個(gè)品種標準有關(guān)物質(zhì)檢查項進(jìn)行了增加或修訂。以青霉胺為例，2020年版藥典標準采用HPLC-UV法，僅能控制青霉胺二硫化物,未控制其他有關(guān)物質(zhì),美國藥典與歐洲藥典也僅能控制青霉胺二硫化物。2025藥典采用HPLC- ELSD法，提高了方法的靈敏度和雜質(zhì)檢測能力,對青霉胺二硫化物和其他雜質(zhì)均實(shí)現了有效控制【1】。
隨著(zhù)藥典標準的不斷升級和優(yōu)化，某些品種采用傳統的HPLC-UV檢測法，已無(wú)法滿(mǎn)足質(zhì)量控制的需求，從而逐漸被新的檢測器所替代。
檢測器作為觀(guān)測化合物出峰的"眼睛"，在高效液相色譜法中承擔著(zhù)舉足輕重的地位，選錯檢測器勢必導致有眼如盲。
本文介紹了高效液相色譜法中常見(jiàn)檢測器的特點(diǎn)和使用考慮要點(diǎn)，旨在分享經(jīng)驗所得。
HPLC中常見(jiàn)的檢測器種類(lèi)及其原理
HPLC中使用最為普遍的是UV檢測器，其原理是基于化合物吸收特定波長(cháng)的UV光產(chǎn)生響應。然而，并非所有的化合物均有紫外吸收，某些化合物即使在低波長(cháng)下，紫外響應也可能較弱，無(wú)法滿(mǎn)足分析方法靈敏度的要求。故而，在正式進(jìn)行分析方法開(kāi)發(fā)前，應對待測化合物的結構進(jìn)行分析，初步評估常規的UV檢測器是否能滿(mǎn)足基本檢測需求，即"是否有響應"。
通常含有共軛體系的化合物在紫外光區均有吸收，如不飽和脂肪酸、醛、酮、以及芳香化合物等。幾乎所有的芳香族化合物在 260nm下都有非常強烈的吸收，擁有一個(gè)或者更多雙鍵的化合物可以在波長(cháng)小于215nm 時(shí)被檢測到【2】。至于"是否能靈敏檢出"，除了化合物本身的紫外吸收屬性，還取決于方法選擇的波長(cháng)、供試品的濃度、進(jìn)樣體積以及對靈敏度要求的高低，方法靈敏度最終需要實(shí)際的數據支持。
對于有紫外吸收但是經(jīng)過(guò)UV光的輻射激發(fā)能產(chǎn)生熒光的化合物，可以選擇熒光檢測器（FLD）來(lái)獲得更高的靈敏度，從而用于痕量測定。如α-三聯(lián)噻吩，使用熒光檢測器獲取的檢出限為0.5 ng/mL，使用二極管陣列檢測器獲取的檢出限為100 ng/mL，兩種檢測器的靈敏度相差了200倍【3】。
對于沒(méi)有紫外吸收的化合物，可以選擇通用檢測器，分析實(shí)驗室最常見(jiàn)的就是示差檢測器（RID）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）。近年來(lái)，電霧式檢測器（CAD）作為ELSD或RID的替代檢測器，由于其出色的靈敏度和重復性，逐漸嶄露頭角。
RID的原理是利用被檢測分子的折光系數與流動(dòng)相的差異，差異越大，檢測的靈敏度越高。然而，RID的靈敏度相比其他檢測器而言，最佳情況下也只能算個(gè)中等水平，故而不適用于痕量測定。藥品檢驗中，通常用于一些糖類(lèi)、醇類(lèi)的含量測定或者聚合物分子量的測定，如HPLC-RID法測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖含量【4】、HPLC-RID法測定磷酸奧司他韋干混懸劑中山梨醇的含量【5】、高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布【6】。
同樣作為通用檢測器，ELSD的靈敏度一般情況下比RID要高出10~100倍【2】。ELSD的原理是在流動(dòng)相蒸發(fā)的基礎上，測量非揮發(fā)性溶質(zhì)顆粒造成的光散射，因此測量靈敏度會(huì )隨著(zhù)待測分析物的揮發(fā)性增加而減弱。ELSD通常用于檢測磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等化合物，比如HPLC-ELSD檢測南極磷蝦油中磷脂含量【7】。另外，ELSD也可用于無(wú)機離子的含量測定【8】。
CAD基于霧化的原理，洗脫液霧化后形成顆粒，經(jīng)過(guò)蒸發(fā)管干燥后與帶電氮氣碰撞，使得分析物顆粒表面帶正電荷，分析物顆粒的質(zhì)量與表面所帶電荷量相關(guān)。由于CAD的通用性強及定量范圍寬等優(yōu)勢，其在皂苷類(lèi)、生物堿類(lèi)、類(lèi)黃酮及有機酸類(lèi)等天然產(chǎn)物的質(zhì)量分析中具有廣泛的應用【9】。
MS檢測器在研發(fā)領(lǐng)域使用也很廣泛，其原理是利用電磁學(xué)原理，將待測樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比(m/z)的大小依次排列收集成質(zhì)譜，可用來(lái)提供分析物的相對分子量和結構信息，常用于化合物的結構確證。但MS檢測器成本較高、對實(shí)驗人員的專(zhuān)業(yè)技能要求也高。
不同檢測器使用時(shí)的考慮要點(diǎn)：
考慮要點(diǎn)1-流動(dòng)相：
UV檢測器要求使用的流動(dòng)相無(wú)吸收，或在被測組分吸收波長(cháng)處無(wú)吸收，因此方法選擇的波長(cháng)應大于流動(dòng)相的截止波長(cháng)。RID要求流動(dòng)相和待測化合物折射率有差異，差異越大，靈敏度越高。ELSD、CAD、MS均要求流動(dòng)相具有揮發(fā)性，而且不含有非揮發(fā)性的添加劑(比如磷酸鹽)。對于UV檢測器，由于流動(dòng)相中可使用非揮發(fā)性緩沖鹽，使用時(shí)應注意緩沖鹽濃度與有機溶劑比例，防止鹽析。
下圖【2】分別提供了一些常見(jiàn)的緩沖液和溶劑的相關(guān)參數，為流動(dòng)相選擇提供參考。
考慮要點(diǎn)2-洗脫方式：
RID一般不適用于梯度洗脫，因為在梯度情況下匹配參比池和樣品池的折射率是極其困難的（RID包含參比池和樣品池，使用前用流動(dòng)相沖洗參比池，以流動(dòng)相為背景做參比，假設采用梯度洗脫方式，實(shí)際的背景一直在變，可參比池卻不能緊跟其變，故而影響響應）。
RID用于等度洗脫時(shí)也不如UV省心， 流動(dòng)相未脫氣、中途更換流動(dòng)相、流動(dòng)相揮發(fā)等都更容易造成RI基線(xiàn)漂移，故而在實(shí)際實(shí)驗過(guò)程中，應盡可能地一次性配制足夠多的流動(dòng)相，并且充分脫氣，避免實(shí)驗中途添加流動(dòng)相或者更換流動(dòng)相瓶，若流動(dòng)相中含有揮發(fā)性溶劑，應用封口膜纏繞瓶口，防止流動(dòng)相揮發(fā)。最后值得關(guān)注的一點(diǎn)是，盡可能地采用單元泵。
其他幾款檢測器，如UV檢測器、MS、CAD、ELSD、FLD，均可用于梯度洗脫。
實(shí)際使用時(shí)，UV檢測器若采用梯度洗脫方式，應盡量避免采用UV吸光度差異較大的兩相作為流動(dòng)相，比如四氫呋喃和水，若必須使用，可考慮在水相中混入一定比例的有機相，降低兩相間差異；另外一個(gè)方式是選擇更高一點(diǎn)的波長(cháng)（這個(gè)措施往往不是很實(shí)際，除非待測化合物在高波長(cháng)處有較好的吸收）。
考慮要點(diǎn)3-溫度：
UV檢測器、MS、CAD、ELSD、FLD受溫度的影響均較小，但RID對溫度變化敏感，主要體現在：對環(huán)境溫度敏感、對柱溫和檢測器溫度差異敏感。因此，實(shí)際使用之前建議至少提前半小時(shí)預熱機器，夏天要及時(shí)開(kāi)啟空調保持環(huán)境溫度可控，方法設置時(shí)應避免柱溫和檢測器溫度差異過(guò)大。
筆者感悟：
每種檢測器都有它的優(yōu)點(diǎn)和使用限制，合理運用、揚長(cháng)避短，才能發(fā)揮他們的核心價(jià)值。
參考文獻：
【1】 2025年版《中國藥典》二部主要增修訂內容解讀
【2】 現代液相色譜導論
【3】 高效液相色譜-熒光檢測法測定化妝品中α-三聯(lián)噻吩
【4】 HPLC-RID法測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖含量
【5】 HPLC-RID法測定磷酸奧司他韋干混懸劑中山梨醇的含量
【6】 高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布
【7】 HPLC-ELSD檢測南極磷蝦油中磷脂含量
【8】 親水作用色譜-蒸發(fā)光散射法測定甲基纖維素中氯離子
【9】 電噴霧檢測器的工作特點(diǎn)及其在藥物分析中的應用進(jìn)展
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