對于生物制品，如**、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及酶等，多以溶液形式生產(chǎn)，這些昂貴的產(chǎn)品在常溫條件下極易發(fā)生蛋白質(zhì)的快速降解導致活性降低。這些產(chǎn)品通常被冷藏儲存和運輸，對冷鏈的依賴(lài)使這些產(chǎn)品更加昂貴。

       目前延長(cháng)生物制品保存期限的方法主要有以下幾種，（1）快速分析核酸技術(shù)（FTA）：FTA卡片是經(jīng)化學(xué)試劑特殊處理的棉纖維卡片，通過(guò)干式化學(xué)穩定基質(zhì)保存生物樣本中的核酸。但FTA卡片只能用于常溫下保存樣品中的核酸，且DNA和RNA只能保存一種，卡片亦不適用于保存及分析生物材料中其他成分比如酶和其他蛋白。（2）福爾馬林固定石蠟包埋技術(shù)：該技術(shù)可將組織在常溫條件下保存較長(cháng)時(shí)間，但處理過(guò)程中固定液的交聯(lián)作用使得DNA受損傷，出現片段化，并且固定和包埋的操作也會(huì )導致RNA和蛋白質(zhì)的質(zhì)量下降。（3）真空冷凍干燥技術(shù)：該技術(shù)是將含有水的生物樣品預先冷凍成固態(tài)，再在低溫低壓條件下進(jìn)行水的升華作用，最后生物樣品低溫脫水而達到干燥的技術(shù)，然而整個(gè)凍干過(guò)程中生物樣品需承受各種各樣的應力，這些應力常常直接或間接導致蛋白不穩定。為了克服以上這些技術(shù)的缺點(diǎn)，玻璃化冷凍技術(shù)應運而生，并且在生物樣本的常溫穩定保存方面表現出極大的優(yōu)勢。

       1.玻璃化冷凍技術(shù)的特點(diǎn)

       玻璃化冷凍技術(shù)是將物質(zhì)轉變成玻璃樣無(wú)定形體的技術(shù)。玻璃化是液態(tài)物質(zhì)在一定的降溫速率下由液相直接傳變?yōu)椴ＡЩ墓腆w狀態(tài)的過(guò)程，期間沒(méi)有晶體結構的生成，也能夠保持液相時(shí)期的分子以及離子的分布，在冷凍和解凍的過(guò)程里也不會(huì )在液態(tài)和晶體之間來(lái)回的變化，這時(shí)所表現出的力學(xué)性質(zhì)與玻璃相似，故稱(chēng)這種狀態(tài)為玻璃態(tài)，是一種介于液態(tài)與固態(tài)之間的狀態(tài)。

       液體在冷凍過(guò)程中以何種狀態(tài)固化，取決于液體黏滯系數、降溫速率及液體總體積。從理論上講，只要獲得足夠的降溫速度，任何液體都可以進(jìn)入玻璃態(tài)。實(shí)現玻璃化需要足夠快的冷卻速度，當溫度下降，勢壘足夠大，此時(shí)分子構象被凍結，與環(huán)境之間由擴散控制的物質(zhì)交換及化學(xué)反應在動(dòng)力學(xué)上受阻，而蛋白質(zhì)大多數降解途徑是由于分子的運動(dòng)性，因此玻璃化體系具有良好的結構和化學(xué)穩定性。發(fā)生玻璃化轉變時(shí)所對應的溫度稱(chēng)之為玻璃化轉變溫度（Tg）。保持制品的玻璃態(tài)需儲存在低于或等于該物質(zhì)的Tg，若制品的Tg高于室溫，則有希望實(shí)現室溫下較長(cháng)時(shí)間的穩定保存。玻璃化冷凍技術(shù)只需達到較高的降溫速度即可，無(wú)特定儀器的需求，比如可直接投入液氮，節約了成本，玻璃化冷凍技術(shù)還有操作步驟簡(jiǎn)便、儲存穩定性好、復蘇率高等優(yōu)勢。此外，在低**的保護劑濃度和較高降溫速度的前提下優(yōu)化玻璃化制品的Tg，可實(shí)現制品的常溫儲存，這對于玻璃化冷凍技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應用具有重要意義。

       2.玻璃化冷凍技術(shù)影響因素

       2.1冷凍保護劑（CPA）

       玻璃化過(guò)程中包含快速降溫步驟，一般需添加CPA。對一般制品來(lái)說(shuō)，其能夠保持玻璃化過(guò)程中制品結構的穩定，對細胞來(lái)說(shuō)，其能夠防止胞內水結晶，避免應力損傷細胞膜。主要分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑。

       滲透性冷凍保護劑主要包括乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜、丙三醇等，它們水溶性較強，可以較為快速的進(jìn)入細胞內，抑制細胞內冰晶的產(chǎn)生，但對細胞有不同程度的**作用。非滲透性保護劑主要為蔗糖、葡聚糖、海藻糖、聚乙烯毗咯烷酮、抗壞血酸等，不能滲透入細胞膜內，只能起到提高細胞外滲透壓的作用。

       2.2降溫速率

       玻璃化過(guò)程中的降溫速率是影響玻璃化效果的重要因素。玻璃化制品中液體在熔點(diǎn)（Tm）以下的溫度時(shí)為過(guò)冷態(tài)，當降溫速度較慢以至于系統可以保持在準熱平衡態(tài)，那么玻璃化制品就可能在Tm處發(fā)生晶化以致不能達到玻璃態(tài)。

       2.3其他因素

       制品的體積及冷凍載體也影響玻璃化制品的降溫速率。越小的冷凍容量，獲得的冷凍效果越好，開(kāi)放性載體如開(kāi)放式麥管、EP管等，制品與液氮直接接觸，能夠實(shí)現更高的降溫速率，但有易污染、保存數量少、成本高等缺點(diǎn)。封閉式載體如拉細麥管、冷凍鉤等，可避免污染，但延長(cháng)了體系在冷凍液中的時(shí)間，對操作要求很高。樣品本身含水量也會(huì )對玻璃化過(guò)程產(chǎn)生影響。一般制品水分含量每增加1%，其玻璃化轉變溫度會(huì )下降5～10℃。

       3.玻璃化冷凍技術(shù)的應用

       3.1蛋白類(lèi)藥物

       基于蛋白質(zhì)的生物藥物，如多肽、單克隆抗體和基因工程抗體、重組**，多嚴格按照冷鏈儲存。玻璃化冷凍技術(shù)可作為理化性質(zhì)不穩定的蛋白質(zhì)藥物制劑的有效制備方法，延長(cháng)藥品的貯存時(shí)間，尤其對于熱敏性蛋白藥物，如昂貴的新型**肺炎球菌結合物，輪狀病毒和HPV**等，能夠實(shí)現非冷鏈條件下穩定儲存的目的。研究通過(guò)用海藻糖和明膠等生產(chǎn)了減毒活沙門(mén)氏菌Ty21a細菌**玻璃體制劑，在37℃時(shí)能夠穩定貯存約3月。

       3.2生物酶

       市面上商品化的生物酶一般與甘油按一定比例混合后在低溫條件下保存，而玻璃化冷凍技術(shù)在生物酶的應用上，亦改善了生物酶制品的存放環(huán)境條件。采Ficoll400和松三糖制得了玻璃化的限制性?xún)惹忻改軌蛟谑覝鼗蛘?7℃條件下穩定存放4個(gè)月，玻璃化酶制品的應用還可避免儲存或運輸過(guò)程中冷鏈斷裂帶來(lái)的假陰性結果，并且延長(cháng)其活性穩定的貯存時(shí)間。

       3.3細胞與胚胎、組織

       玻璃化冷凍技術(shù)在細胞與胚胎、組織中已應用良多，采用玻璃化冷凍技術(shù)的優(yōu)勢主要體現在顯著(zhù)改善其復蘇率方面，并且開(kāi)發(fā)出新的細胞、胚胎、組織和器官等的保存方法。在冷凍保護液中對人類(lèi)受精卵進(jìn)行玻璃化，20個(gè)受精卵在玻璃化過(guò)程中皆存活，18個(gè)受精卵在培養24h后恢復分裂。

       3.4食品

       食品在低于Tg時(shí)貯藏能最 大限度的保存食品質(zhì)量。在玻璃態(tài)下，由于分子運動(dòng)的限制，造成食品品質(zhì)變化的一切受擴散控制的反應均變得十分緩慢，甚至不會(huì )發(fā)生。此時(shí)食品的各方面性質(zhì)都很穩定，對食品的貯藏和鮮度等品質(zhì)的維持非常有利。對帶魚(yú)制品進(jìn)行玻璃化發(fā)現，添加保護液的帶魚(yú)制品各指標的下降速度均低于空白對照組，玻璃化魚(yú)肉可以抑制蛋白質(zhì)冷凍變性、保持蛋白質(zhì)原有結構和功能，比普通貯藏的保鮮期延長(cháng)了約20d。

       玻璃化冷凍技術(shù)的主要目的在于實(shí)現更長(cháng)時(shí)間，更簡(jiǎn)便條件的儲存，其憑借顯著(zhù)的優(yōu)勢已經(jīng)廣泛應用到諸多領(lǐng)域。玻璃化冷凍技術(shù)的未來(lái)發(fā)展空間在于Tg的提高，高的Tg不僅能夠提高貯存穩定性，還可以實(shí)現產(chǎn)品的常溫條件下的儲存。影響玻璃化冷凍技術(shù)效果以及Tg的因素，主要是CPA的組成、進(jìn)行玻璃化時(shí)的降溫速率、玻璃化載體的選擇，并且開(kāi)發(fā)新的玻璃化載體也是未來(lái)研究的方向。對于生物藥物，雖說(shuō)玻璃化態(tài)在非冷鏈下存放已實(shí)現，甚至能保持數月，但還需要大規模重復安全性和免疫原性研究以獲得玻璃化改進(jìn)的批準，所以現有生物藥物到玻璃化狀態(tài)的發(fā)展還需時(shí)日。

       參考文獻：

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       [2]徐利,葛鳳菊,黃亞.玻璃化冷凍技術(shù)的應用及研究進(jìn)展[J].現代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2018,27(01):75-78.DOI:10.13283/j.cnki.xdfckjz.2018.01.019.

       作者簡(jiǎn)介：沙羅，中藥研發(fā)工作者，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，致力于中藥新藥的研究開(kāi)發(fā)。