雙特異性抗體（bsAbs）是可以結合同一目標或不同目標上的兩個(gè)表位的抗體。它們能夠同時(shí)靶向兩個(gè)目標，從而實(shí)現新的作用機制（例如，雙重抑制信號通路和招募效應細胞）。因此，雙特異性抗體已成為治療癌癥和其他疾病的強大工具。近年來(lái)，處于研發(fā)階段的治療性雙特異性抗體數量顯著(zhù)增加。

       目前，雙特異性抗體主要通過(guò)重組方法生成，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種不同的形式。根據其形式，雙特異性抗體可以大致分為兩大類(lèi)：包含Fc區的IgG樣分子和缺乏Fc區的較小非IgG樣分子。一般來(lái)說(shuō)，IgG樣雙特異性抗體的生產(chǎn)技術(shù)難度高于無(wú)Fc區的對應物。根據其結構對稱(chēng)性，IgG樣雙特異性抗體可以進(jìn)一步分為兩大亞組：非對稱(chēng)雙特異性抗體和對稱(chēng)雙特異性抗體（圖8.1）。每種亞組雙特異性抗體的純化通常都面臨獨特的挑戰。在介紹IgG樣雙特異性抗體純化的一般路線(xiàn)圖之前，將簡(jiǎn)要回顧與每種亞組雙特異性抗體相關(guān)的常見(jiàn)副產(chǎn)物及其去除方法。

       非對稱(chēng)雙特異性抗體

       非對稱(chēng)雙特異性抗體通常源自?xún)煞N具有不同結合特異性的親本抗體，因此包含四條不同的鏈：兩條不同的重鏈（HCs）和兩條不同的輕鏈（LCs）。當這些鏈在生產(chǎn)細胞中共表達時(shí)，需要不同抗原特異性的重鏈發(fā)生異二聚體化。此外，針對一種抗原的輕鏈必須與針對相同抗原的相應重鏈配對。然而，如果允許這四條鏈隨機配對，錯誤組裝的物種（例如，同二聚體、含有錯誤配對輕鏈的分子）可能占總質(zhì)量的約90%。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種蛋白質(zhì)工程技術(shù)以強制正確的鏈配對。其中，knobs-into-holes（KiH）和CrossMab技術(shù)是應用最廣泛的兩種方法，分別用于克服重鏈同二聚體化和輕鏈錯誤配對的障礙。然而，盡管這些方法設計精巧，但無(wú)法完全避免錯誤鏈配對。此外，鏈表達不平衡和次優(yōu)培養條件可能導致其他副產(chǎn)物（例如，半抗體）。以下部分將簡(jiǎn)要介紹去除同二聚體和半抗體的方法。

       同二聚體

       一般來(lái)說(shuō)，同二聚體難以去除，因為它們通常表現出與目標雙特異性抗體相似的物理化學(xué)特性。有效清除同二聚體需要充分利用每種雙特異性抗體設計的獨特性。有些特殊設計使得同二聚體與異二聚體雙特異性抗體的分離相對較為簡(jiǎn)單。由于不同設計的同二聚體表現出不同的特性，其去除方法將分別討論。

       采用knobs-into-holes技術(shù)構建的雙特異性抗體

       許多非對稱(chēng)IgG樣雙特異性抗體采用了knobs-into-holes技術(shù)來(lái)促進(jìn)重鏈異二聚體化（圖8.2A）。然而，盡管這種策略顯著(zhù)提高了異二聚體的形成，但同二聚體化仍可能在低水平（例如，5%）發(fā)生。特別是，與knob-knob同二聚體相比，hole-hole同二聚體更為常見(jiàn)，其形成受到knob的一定程度阻礙。因此，如果"hole"重鏈表達過(guò)量，同二聚體可能成為主要的副產(chǎn)物。

       張等人最近發(fā)現，與knobs-into-holes設計穩定的異二聚體相比，hole-hole同二聚體在低pH條件下穩定性較低。在低pH條件下，hole-hole同二聚體會(huì )發(fā)生構象變化，變得更疏水。利用hole-hole同二聚體對低pH的高敏感性以及隨后的構象/疏水性變化，可以促進(jìn)其分離。在最近的一項研究中，我們發(fā)現，當在略低于通常使用的pH值（例如，pH 4.5，而不是pH 5.5）的條件下加載時(shí)，Capto MMC ImpRes能夠提高hole-hole同二聚體與knobs-into-holes異二聚體之間的分辨率。此外，通過(guò)在洗滌和洗脫緩沖液中加入5%（體積分數）聚乙二醇（PEG）3350，可以進(jìn)一步增強分辨率（作者未發(fā)表的工作）。這種方法對于去除采用knobs-into-holes設計的雙特異性抗體中的hole-hole同二聚體副產(chǎn)物應具有普遍價(jià)值。

       基于靜電相互作用驅動(dòng)異二聚體化的雙特異性抗體

       在CH3界面不同位置引入電荷置換是另一種促進(jìn)重鏈異二聚體化的替代策略（圖8.2B）。一般來(lái)說(shuō)，將帶有相反電荷的殘基引入互補的CH3區域。異二聚體化受到吸引性靜電相互作用的青睞，而同二聚體形成則受到排斥性電荷相互作用的阻礙。與knobs-into-holes設計中兩種類(lèi)型的同二聚體受到的抑制程度不相等不同，在靜電導向的情況下，對兩種同二聚體的抑制效果是均等的。

       在一項研究中，作者發(fā)現，對于具有不同電荷置換的設計，異二聚體水平范圍為87%至100%，表明這是一種促進(jìn)異二聚體形成的有效方法。對于選定的設計，當兩種重鏈以1:1的比例表達時(shí)，通?？梢匀〉米罴呀Y果。然而，兩種同二聚體仍可能以少量產(chǎn)生，但可以通過(guò)陽(yáng)離子交換（CEX）色譜法有效去除，因為同二聚體和異二聚體通常由于電荷置換而具有相當不同的電荷特性。

       基于WuXiBody平臺的雙特異性抗體

       WuXi Biologics最近開(kāi)發(fā)了一種新的雙特異性抗體平臺：WuXiBody（圖8.2C）。在一個(gè)Fab臂中，恒定區（CH1/CL）被T細胞受體（TCR）恒定域所取代。此外，通過(guò)非天然的鏈間二硫鍵增強了TCR α和β區域之間的相互作用。這種設計確保了相應的重鏈-輕鏈配對，并且當與knobs-into-holes技術(shù)結合時(shí)，可以大大解決雙特異性抗體構建中的鏈錯配問(wèn)題。

       TCR恒定域具有相對較低的等電點(diǎn)（pI），這一特性可用于促進(jìn)同二聚體的去除。在基于WuXiBody格式和knobs-into-holes策略設計雙特異性抗體時(shí)，最好將TCR域包含在"knob"半抗體中。此外，"hole"半抗體應略微過(guò)量表達。這樣，主要副產(chǎn)物將是"hole"半抗體和hole-hole同二聚體。這兩種副產(chǎn)物不含TCR域，因此其pI高于含有低pI TCR域的雙特異性抗體。這種pI差異有助于通過(guò)陰離子交換（AEX）色譜法去除hole-hole同二聚體。例如，在適當的條件下，低pI雙特異性抗體可結合到AEX柱上，而高pI的hole-hole同二聚體則不結合，留在流穿液（FT）中。

       基于pI工程的重鏈雙特異性抗體

       pI工程是促進(jìn)雙特異性抗體純化的一種有效手段。在此方法中，通過(guò)突變改變一條重鏈的pI值，以增加雙特異性抗體與同二聚體副產(chǎn)物之間的pI差異。pI工程可應用于重鏈可變區或Fc區（圖8.2D）?；蛘?，可使用具有不同pI的不同亞類(lèi)（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）的恒定區作為構成雙特異性抗體的兩條重鏈的恒定區（例如，將一種親本單抗重鏈的恒定區替換為來(lái)自不同亞類(lèi)的恒定區，以生成亞類(lèi)雜交雙特異性抗體）。增加的pI差異極大地有助于通過(guò)離子交換（IEX）色譜法純化目標雙特異性抗體。在最近的一項研究中，IEX色譜法使用pH梯度比使用鹽梯度展現出更高的分辨率。作者表明，即使兩種親本抗體之間的pI差異非常?。?.1個(gè)pH單位），也可以使用高度線(xiàn)性的pH梯度實(shí)現異二聚體與同二聚體之間的適當分離。

       基于蛋白A結合能力廢除的重鏈雙特異性抗體

       一種類(lèi)似于pI工程的策略，也可有效簡(jiǎn)化同二聚體去除，即修改一條重鏈Fc的蛋白A結合親和力（圖8.2E）。在這種設計中，一個(gè)重鏈Fc結構域的蛋白A結合能力被廢除（稱(chēng)為Fc*）。然后，雙特異性抗體和兩個(gè)同二聚體將分別包含FcFc和FcFc/FcFc*。由于蛋白A結合廢除取代，雙特異性抗體（FcFc*）應具有介于FcFc和FcFc同二聚體之間的中間結合親和力，后兩者分別表現出正常和嚴重降低的結合親和力。已知人IgG3亞型不與蛋白A結合，因此源自人IgG3的Fc鏈是一種天然存在的Fc*?；蛘?，可通過(guò)將野生型Fc CH3結構域中對蛋白A結合至關(guān)重要的殘基替換為IgG3中的相應殘基來(lái)生成Fc*。

       由此產(chǎn)生的工程化親和力層次結構有助于使用蛋白A色譜法將所需的雙特異性抗體與同二聚體雜質(zhì)分離。FcFc同二聚體不會(huì )結合，因此出現在流穿液中。雙特異性抗體（Fc*Fc）和FcFc同二聚體都會(huì )結合，但親和力不同：前者結合得不如后者緊密。弱結合的雙特異性抗體可以在較不嚴格的pH條件下選擇性洗脫，而在此條件下，緊密結合的FcFc同二聚體得以保留。通過(guò)在洗脫緩沖液中加入CaCl2或MgCl2，可以進(jìn)一步改善雙特異性抗體與FcFc同二聚體之間的分離。人們認為，通過(guò)調節抗體與蛋白A配體之間的疏水相互作用，可以實(shí)現改善的分辨率。

       通用重鏈雙特異性抗體 - kl體

       采用通用重鏈的雙特異性抗體設計完全避免了重鏈配對問(wèn)題，雙特異性由兩條不同的輕鏈賦予：一條κ鏈和一條λ鏈（圖8.2F）。在這種設計中，未引入任何突變或外源序列。除了所需的kl體外，當三條鏈（重鏈、κ輕鏈和λ輕鏈）共表達時(shí)，還會(huì )產(chǎn)生單κ和單λ同二聚體。然而，kl體的獨特性質(zhì)使得這兩種雜質(zhì)（κκ和λλ）能夠通過(guò)依次使用KappaSelect和LambdaFabSelect樹(shù)脂進(jìn)行親和純化而易于去除，這兩種樹(shù)脂分別結合κ和λ輕鏈的恒定區。雖然雙特異性kl體可以結合這兩種樹(shù)脂，但單λ和單κ同二聚體分別在KappaSelect和LambdaFabSelect的柱流穿液中被消除，最終得到純化的kl體。盡管這兩種親和色譜的順序可以互換，但如果一種單特異性物質(zhì)的含量高于另一種（例如，如果單λ多于單κ，則KappaSelect應置于LambdaFabSelect之前），則最好先去除主要的單特異性物質(zhì)，以便為靶kl體節省大部分柱的載樣容量。

       單鏈可變片段（scFv）-Fc

       單鏈可變片段（scFv）是通過(guò)連接重鏈和輕鏈的可變區構建而成的，兩者之間通過(guò)連接肽相連。作為一種避免重鏈-輕鏈錯配的策略，一些雙特異性抗體采用了Fab-scFv格式，其中一個(gè)Fab臂被scFv所取代。在這種設計中，需要共表達三條鏈（重鏈、輕鏈和scFv-Fc）以組裝雙特異性抗體。在某些情況下，scFv-Fc表達過(guò)量，成為主要的雜質(zhì)。由于scFv-Fc包含Fc區，因此無(wú)法使用蛋白A親和色譜法將其與目標雙特異性抗體分離。然而，雙特異性抗體和scFv-Fc之間的區別在于，前者含有輕鏈恒定區，而后者則沒(méi)有。這一區別有助于使用替代的親和樹(shù)脂KappaSelect進(jìn)行分離，該樹(shù)脂特異性結合κ輕鏈的恒定區。雖然雙特異性抗體可以通過(guò)其Fab臂與KappaSelect結合，但缺乏輕鏈恒定區的scFv-Fc則無(wú)法結合。這種方法為去除scFv-Fc單體和同二聚體提供了一種有效手段。值得注意的是，另一種κ輕鏈結合的親和介質(zhì)ProteinL樹(shù)脂，它結合的是可變區而不是恒定區，因此無(wú)法區分scFv-Fc和雙特異性抗體。由于scFv（單體和二聚體）可以通過(guò)KappaSelect輕松去除，因此在生產(chǎn)采用Fab-scFv格式的雙特異性抗體時(shí)，最好讓scFv的表達量略過(guò)量，以盡量減少含有正常Fab臂的同二聚體的形成，因為這些同二聚體可能難以去除。

       半抗體

       半抗體是雙特異性抗體生產(chǎn)中的常見(jiàn)雜質(zhì)。在某些情況下，它是由于有意過(guò)量表達無(wú)法形成同二聚體的重鏈而產(chǎn)生的。由于半抗體僅含有一個(gè)Fc結構域，因此其與蛋白A樹(shù)脂的結合能力弱于含有完整Fc區的雙特異性抗體。因此，在線(xiàn)性pH梯度洗脫時(shí)，半抗體會(huì )比雙特異性抗體更早地從蛋白A柱中洗脫出來(lái)。通過(guò)在流動(dòng)相中加入鹽類(lèi)，可以進(jìn)一步改善半抗體與完整抗體之間的分辨率。根據線(xiàn)性pH梯度洗脫結果，可以開(kāi)發(fā)出一種包含分步pH洗脫和中間pH洗滌的工藝。中間洗滌的pH值需要足夠低，以洗脫半抗體，同時(shí)仍能保留結合在柱上的雙特異性抗體。最佳洗滌pH值取決于裝載密度。當柱子以低密度裝載時(shí)應使用相對較低的pH值，而以高密度裝載時(shí)應使用較高的pH值，以實(shí)現有效的半抗體清除和合理的收率。一般來(lái)說(shuō)，由于這種工藝具有負荷敏感性，因此不夠穩健。

       羥基磷灰石（HA）是一種介導陽(yáng)離子交換和金屬親和相互作用的混合模式樹(shù)脂，它也可以在一定程度上分離半抗體和完整的雙特異性抗體。一般來(lái)說(shuō)，在線(xiàn)性鹽梯度洗脫條件下，半抗體會(huì )比雙特異性抗體更早地洗脫出來(lái)。在一個(gè)案例研究中，雙特異性抗體的純度從裝載時(shí)的33%提高到洗脫液中的80%。在另一個(gè)例子中，雙特異性抗體的純度從77%提高到97%。Gagnon等人先前表明，在梯度起始和梯度結束緩沖液中加入5%至10%的聚乙二醇（PEG），可以顯著(zhù)提高HA的分辨率。因此，在存在PEG的情況下，可以預期半抗體和雙特異性抗體之間能夠實(shí)現更完全的分離。在線(xiàn)性梯度洗脫下的觀(guān)察結果還表明，可以開(kāi)發(fā)出分步洗脫工藝，并且通過(guò)選擇合適的洗滌條件，可以實(shí)現半抗體的大量清除。

       除了HA之外，另一種混合模式樹(shù)脂Capto MMC在適當的條件下也可以很好地清除半抗體。Capto MMC具有陽(yáng)離子交換和疏水基團。結合在柱上的蛋白質(zhì)可以通過(guò)線(xiàn)性鹽或pH梯度進(jìn)行洗脫。一般來(lái)說(shuō)，半抗體的結合能力弱于雙特異性抗體，通常出現在早期洗脫分數中（作者未發(fā)表的工作）。根據線(xiàn)性梯度洗脫的結果，可以引入一個(gè)洗滌步驟，在分步洗脫過(guò)程中選擇性地去除半抗體。

       最后，如果半抗體的等電點(diǎn)（pI）與雙特異性抗體的pI有顯著(zhù)差異，那么可以通過(guò)離子交換（IEX）色譜法實(shí)現這兩種物質(zhì)的分離。

       對稱(chēng)雙特異性抗體

       對于采用對稱(chēng)格式的雙特異性抗體，雙特異性通常是通過(guò)在輕鏈或重鏈的任一末端融合第二個(gè)抗原結合單元來(lái)實(shí)現的。由于對稱(chēng)雙特異性抗體是通過(guò)鏈延伸而不是引入不同的鏈來(lái)實(shí)現雙特異性的，因此通常與非對稱(chēng)雙特異性抗體相比，產(chǎn)生的副產(chǎn)物數量較少。然而，對稱(chēng)格式的雙特異性抗體顯示出顯著(zhù)增加的聚集傾向。在某些情況下，聚集物含量高達50%。聚集物可能是由于鏈長(cháng)增加和柔韌性提高導致的分子間結構域交換而形成的。對于對稱(chēng)雙特異性抗體，聚集物去除成為下游處理的主要任務(wù)。以下部分將分別介紹幾種提供良好聚集物清除能力的色譜法。

       蛋白A色譜法

       一般來(lái)說(shuō)，在典型條件下，蛋白A色譜法去除聚集物的效果不如一些替代色譜策略。盡管已知聚集物的結合能力比單體更強，但它們通常與單體共同洗脫，僅通過(guò)調整洗脫pH值通常不足以實(shí)現良好的分離。最近，我們開(kāi)發(fā)了一種方法，可以顯著(zhù)提高蛋白A去除聚集物的能力，允許在捕獲步驟中去除大部分聚集物。特別是，我們發(fā)現，在流動(dòng)相中加入PEG/氯化鈣或PEG/氯化鈉組合可以顯著(zhù)提高單體與聚集物之間的分辨率。對于用于方法開(kāi)發(fā)和演示的案例，優(yōu)化后的程序可將聚集物從大于20%降低到大約3%至4%。這種方法減輕了蛋白A后拋光步驟的聚集物去除負擔，并提高了下游工藝的整體穩健性。

       疏水相互作用色譜法（HIC） HIC通常用于去除聚集物，并已被證明非常有效。HIC通常以流穿模式運行，用于此目的。聚集物通常比單體更疏水，可以選擇適當的條件，使單體流穿，而聚集物結合。不同供應商提供的HIC樹(shù)脂具有不同程度的疏水性。根據所使用的特定HIC樹(shù)脂，需要調整裝載中的鹽濃度以獲得最佳結果。例如，在一項研究中發(fā)現，對于相同的裝載，使用中等疏水性的Phenyl 650 M HIC樹(shù)脂時(shí)需要0.5 M硫酸銨，而使用高疏水性的POROS Benzyl UltraHIC樹(shù)脂時(shí)只需要50 mM氯化鈉。

       Capto MMC ImpRes和Capto adhere色譜法

       Capto MMC ImpRes是Capto MMC的分辨率改進(jìn)版本。與Capto MMC相比，Capto MMC ImpRes的珠子大小和配體密度都有所降低，從而提高了單體與聚集物之間的選擇性。根據供應商的應用說(shuō)明，在pH 5.0至7.0和氯化鈉濃度0至150 mM之間可以獲得高結合容量，而在pH 5.0時(shí)可實(shí)現高純度。在之前的一項研究中，我們發(fā)現，當使用氯化鈉洗脫柱子時(shí)，可以獲得良好的聚集物清除效果，但洗脫峰尾部顯著(zhù)?？紤]到結合涉及疏水相互作用，這并不令人驚訝。通過(guò)使用精氨酸洗脫柱子，可以在不犧牲分辨率的情況下改善峰展寬，因為精氨酸可以破壞靜電和疏水相互作用。

       Capto adhere是另一種能夠去除聚集物的混合模式樹(shù)脂。其配體含有能夠進(jìn)行陰離子交換、疏水相互作用和氫鍵的基團。對于聚集物去除，Capto adhere通常以流穿模式運行。根據供應商的應用說(shuō)明，聚集物清除受pH值、電導率和裝載量的影響。一般來(lái)說(shuō)，較高的pH值、較高的電導率和/或較低的裝載量可實(shí)現更好的聚集物清除效果。如果在流穿模式下無(wú)法實(shí)現良好的聚集物去除，則可以嘗試結合-洗脫模式。

       HA色譜法

       HA色譜法以其強大的聚集物去除能力而聞名。例如，一項研究表明，HA可將聚集物水平從超過(guò)60%降低到不到0.1%。HA是一種混合模式樹(shù)脂，能夠進(jìn)行磷酸鹽陽(yáng)離子交換和鈣金屬親和相互作用。這兩種相互作用協(xié)同作用，但其中一種可能在特定蛋白質(zhì)的保留中占主導地位。磷酸鹽廣泛用于洗脫，因為它可以破壞這兩種相互作用。而氯化鈉對金屬親和相互作用的影響則微乎其微。大多數抗體主要通過(guò)陽(yáng)離子交換相互作用結合，聚集物的結合能力比單體更強。一般來(lái)說(shuō)，使用固定磷酸鹽濃度的氯化鈉梯度洗脫比使用磷酸鹽梯度可以獲得更好的分辨率。先前的研究表明，當將PEG加入流動(dòng)相中時(shí)，可以增強蛋白質(zhì)在HA柱上的保留，且增強程度與蛋白質(zhì)大小成正比，這表明PEG優(yōu)先增強聚集物的保留，從而實(shí)現單體和聚集物之間更完全的分離。

       陽(yáng)離子交換（CEX）色譜法

       陽(yáng)離子交換色譜法廣泛用于抗體純化的拋光步驟。然而，在典型條件下，它對聚集物的分辨率能力有限。盡管聚集物通常比單體蛋白質(zhì)結合得更緊密，但兩種物質(zhì)之間的分辨率通常較低，尤其是當聚集物為二聚體時(shí)（聚集物峰通常出現在單體峰尾部的肩部）。因此，為了實(shí)現足夠的聚集物清除，必須犧牲收率。陽(yáng)離子交換色譜法通常在酸性條件下運行，這與大多數抗體的等電點(diǎn)相距甚遠。然而，最近的一項研究表明，堿性pH值的陽(yáng)離子交換色譜法實(shí)現了改善的聚集物去除效果。我們在之前的一項研究中使用POROS XS和Capto SP ImpRes在酸性pH值下進(jìn)行線(xiàn)性鹽梯度洗脫時(shí)，發(fā)現單體和聚集物之間的分離效果較差。然而，當在洗滌和洗脫緩沖液中加入5% PEG 3350時(shí)，我們觀(guān)察到兩種樹(shù)脂的分離效果顯著(zhù)改善。與HA色譜法的情況一樣，PEG增加了蛋白質(zhì)的保留，且這種效果的大小與蛋白質(zhì)大小成正比。在PEG存在的情況下，聚集物結合得更緊密，主要出現在洗脫液中。

       純化路線(xiàn)圖

       通過(guò)總結前文提供的信息，我們繪制了圖8.3所示的IgG樣雙特異性抗體純化路線(xiàn)圖。對于每種常見(jiàn)的副產(chǎn)物類(lèi)型，都提供了一條或多條導向其去除的路徑。對于特定類(lèi)型的副產(chǎn)物，可以依次使用互補的純化路徑，以實(shí)現最佳的清除效果。例如，蛋白A和MMC都能去除半抗體，因此將它們結合起來(lái)應該能夠更完全地去除這種副產(chǎn)物。同樣，當蛋白A與MMC或HA色譜法結合使用時(shí)，可以預期實(shí)現更好的聚集物清除效果。

       總結

       一般來(lái)說(shuō)，IgG樣雙特異性抗體是通過(guò)重新組裝來(lái)自?xún)煞N不同抗體的鏈或在現有抗體上附加一個(gè)抗原結合單元生成的，分別形成非對稱(chēng)和對稱(chēng)分子。非對稱(chēng)雙特異性抗體的構建涉及多條不同的鏈，因此這種類(lèi)型的雙特異性抗體的表達通常會(huì )因隨機鏈配對和鏈表達不平衡而伴隨各種副產(chǎn)物。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出幾種策略來(lái)促進(jìn)正確組裝，但無(wú)法完全避免副產(chǎn)物的形成。對稱(chēng)雙特異性抗體的構建涉及較少的鏈，但這種類(lèi)型的雙特異性抗體由于鏈長(cháng)增加通常會(huì )導致穩定性降低和聚集水平升高。對于任何格式的雙特異性抗體，相關(guān)的雜質(zhì)都給下游純化帶來(lái)了相當大的挑戰。特別是，由于副產(chǎn)物的種類(lèi)和相對含量因個(gè)案而異，很難開(kāi)發(fā)出一種能夠滿(mǎn)足每種個(gè)體雙特異性抗體純化需求的平臺方法。通過(guò)收集文獻中可用的針對雙特異性抗體特異性雜質(zhì)去除的信息，我們生成了一個(gè)路線(xiàn)圖，為雙特異性抗體純化提供了一般性指導。雖然雙特異性抗體相關(guān)的副產(chǎn)物最終需要通過(guò)純化過(guò)程去除，但解決雙特異性抗體獨特的雜質(zhì)問(wèn)題不應完全依賴(lài)于下游工藝。強烈建議在上游階段（即分子設計、細胞系開(kāi)發(fā)和細胞培養開(kāi)發(fā)）進(jìn)行優(yōu)化，以減輕下游的負擔。

       對于非對稱(chēng)雙特異性抗體，需要選擇一種能夠強制正確鏈配對的適當策略。此外，所選策略可以與一種促進(jìn)分離的策略相結合，這為去除仍可能以少量產(chǎn)生的潛在副產(chǎn)物提供了一種有效手段。例如，在一項研究中，通過(guò)將knobs-into-holes技術(shù)與pI工程相結合，實(shí)現了高效率的異二聚體化（>90%）以及從同二聚體副產(chǎn)物中直接分離雙特異性抗體。在另一個(gè)案例中，Skegro等人通過(guò)將促進(jìn)重鏈異二聚體化的技術(shù)與非對稱(chēng)蛋白A結合策略相結合，實(shí)現了90%至95%的異二聚體高收率和穩健的同二聚體痕跡去除。對于對稱(chēng)雙特異性抗體，對附加結構域和連接鏈的優(yōu)化工程對于最小化聚集至關(guān)重要。例如，在IgG-scFv的情況下，通過(guò)在scFv部分引入VH-VL鏈間二硫鍵來(lái)穩定scFv部分，并調整連接scFv與其余分子部分的連接鏈長(cháng)度，可以顯著(zhù)減少聚集物的量。

       除了分子設計外，平衡各條鏈的表達對于良好的雙特異性抗體收率至關(guān)重要。在某些情況下，鏈表達不協(xié)調可能導致副產(chǎn)物增加，從而降低正確組裝的雙特異性抗體的百分比。然而，另一方面，一項研究表明，輕鏈的輕微過(guò)量表達是有利的，因為它促進(jìn)了雙特異性抗體的組裝，并避免了3/4抗體（缺少一條輕鏈的抗體）的產(chǎn)生?？赡苄枰⒄{才能獲得最佳結果。此外，培養條件也可能對最終的雜質(zhì)特征產(chǎn)生影響。因此，在雙特異性抗體的情況下，需要篩選更多的載體構建、質(zhì)粒比例、小池和培養條件，以實(shí)現高生產(chǎn)力并降低產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。

       總之，盡管團隊合作對于生產(chǎn)任何治療性抗體都至關(guān)重要，但對于這種復雜性顯著(zhù)增加的雙特異性抗體來(lái)說(shuō)，尤其如此。在上游工作充分優(yōu)化的情況下，本工作中提供的純化路線(xiàn)圖才能發(fā)揮其最大的作用。