編者按：體內CART已然成為研究熱點(diǎn)，就在昨日，8月21日，吉利德公司 (Nasdaq: GILD) 旗下的Kite宣布，以3.5億美元收購Interius BioTherapeutics，Interius是一家開(kāi)發(fā)體內 CAR 療法的生物技術(shù)公司。從官網(wǎng)來(lái)看，技術(shù)路徑走的是慢病毒路徑。如今體內CART主要有兩類(lèi)技術(shù)流派，目前來(lái)看LNP有LNP的問(wèn)題，慢病毒有慢病毒載體的問(wèn)題。體內CART雖然很熱門(mén)。但并不是一個(gè)成熟的技術(shù)平臺，仍然有很多需要探索的。同時(shí)能否優(yōu)于TCE，或者下一代TCE也是很難說(shuō)的。今天邀請了一位在體內CART研究頗深的專(zhuān)家來(lái)討論這個(gè)話(huà)題。這也是首次Antibody Research公眾號約稿。

       當談?wù)揑N VIVO CAR-T的時(shí)候，到底在討論什么

       最近組織了好幾場(chǎng)關(guān)于IN VIVO CAR-T領(lǐng)域的閉門(mén)會(huì )，邀請了相關(guān)領(lǐng)域的研發(fā)者、創(chuàng )始人和投資人等，引起了一些反響，大家都希望我寫(xiě)寫(xiě)總結。我自知天生愚鈍，文筆拙劣，擔心不能把各專(zhuān)家的真知灼見(jiàn)準確地表達出來(lái)，一直未動(dòng)筆。不過(guò)最近看到行業(yè)逐漸熱鬧起來(lái)，行業(yè)潛在的問(wèn)題似乎被有意無(wú)意的被隱藏起來(lái)，覺(jué)得還是有必要和大家好好聊聊。今天出第一期，主要聚焦下面3個(gè)問(wèn)題：

       1.為什么IN VIVO CAR-T的熱潮是在當下？

       2.如何看待各病毒載體的IN VIVO CAR-T技術(shù)平臺？

       3.未來(lái)的技術(shù)演化到底要關(guān)注哪些問(wèn)題？

       為什么IN VIVO CAR-T的熱潮是在當下

       記得2021年CAR-(i)NK正火爆的時(shí)候，我在一個(gè)會(huì )議上問(wèn)了個(gè)問(wèn)題：2017年FDA就批準了CAR-T上市，作為同樣重要的免疫細胞，為什么CAR-(i)NK產(chǎn)業(yè)發(fā)展還在這么早期？到底什么原因導致了CAR-(i)NK的發(fā)展進(jìn)度遠慢于CAR-T呢?現在的這些原因都解決了嗎？后續基于上面的疑問(wèn)，我出了幾篇關(guān)于CAR-(i)NK的行業(yè)報告，在這些報告里面，比較準確的提示出CAR-(i)NK技術(shù)平臺的風(fēng)險與優(yōu)勢、面臨的挑戰、成藥性的困難等，并且對當時(shí)的某外國明星CAR-(i)NK企業(yè)的巨大風(fēng)險發(fā)出警示，幾個(gè)月該公司的數據發(fā)布后，股價(jià)一泄千里至今還在低谷。

       同樣的邏輯，上述的幾個(gè)問(wèn)題，可以問(wèn)問(wèn)當下的IN VIVO CAR-T，到底是怎樣的底層邏輯決定了IN VIVO CAR-T現在可以爆發(fā)？可以成藥？可以成為大藥？

       體外自體和異體CAR-T細胞療法與體內CAR-T細胞療法的概述

       我們知道IN VIVO CAR-T能成藥的關(guān)鍵點(diǎn)是在于載體的成功，一個(gè)理想的載體需要能滿(mǎn)足以下幾條：

       ①特異性靶向:在體內只有效轉染(靜息態(tài))T細胞,避免非特異性基因轉導和脫靶效應。

       ②高效的轉染效率:讓體內達到一定數量的CAR-T細胞才能獲得潛在治療效果;確保CAR基因在T細胞中的穩定表達和功能活性。

       ③較低的免疫原性。

       ④避免載體失活:避免被自身免疫系統和補體系統滅活。

       ⑤生產(chǎn)簡(jiǎn)易，成本極低

       所以對于各IN VIVO CAR-T平臺/公司的評估，評估其載體特點(diǎn)及后續的轉染、表達、安全性等參數是重中之重。目前主流的載體分為病毒載體和非病毒載體，后續我將根據載體及代表公司，做個(gè)系列的文章來(lái)梳理。今天重點(diǎn)來(lái)討論一下病毒載體，特別是慢病毒載體。

       1.病毒載體技術(shù)路徑發(fā)展沿革

       慢病毒載體結構及特點(diǎn)：

       慢病毒屬于逆轉錄病毒科的RNA病毒家族。早期慢病毒載體，由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)改裝而來(lái)，隨后，貓免疫缺陷病毒(FIV)、猿類(lèi)免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、綿羊髓鞘脫落病毒(MVV)等載體相繼研發(fā)。

       慢病毒載體的結構：

       第一代慢病毒載體為雙質(zhì)粒系統，基本保留了HIV的所有組件，包膜通常采用 VSV-G，以增強載體的廣譜感染能力。雖然這種系統實(shí)現了基因轉送，但由于包含大量HIV 元件，存在生成復制性慢病毒（RCL）的風(fēng)險，因此逐步被更安全的設計所取代。

       第二代慢病毒載體為三質(zhì)粒系統，分為包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和載體質(zhì)粒，第 2代系統去除了所有 HIV 的輔助基因（vif、vpr、vpu、nef），僅保留必要的結構（gag、pol）和調控（tat、rev）功能基因。盡管同樣采用三質(zhì)粒模式，但由于輔助基因被刪除，RCL 風(fēng)險顯著(zhù)降低。這一代系統廣泛被實(shí)驗室用于研究場(chǎng)景，部分仍依賴(lài) Tat 激活 5′ LTR，從而體現其對 Tat 的依賴(lài)性。

       第三代慢病毒載體系統進(jìn)一步強化了安全性，進(jìn)行了多個(gè)關(guān)鍵優(yōu)化：

       Tat 基因被完全移除，并采用融合型異源啟動(dòng)子（如 CMV 或 RSV）替代 5′ LTR，從而去除了對 Tat 的依賴(lài)；

       包裝功能分離：將gag/pol 和 rev 放在不同質(zhì)粒內，再加上單獨的包膜質(zhì)粒與轉導質(zhì)粒，共形成四質(zhì)粒系統；

       引入自失活（SIN）設計：刪除 3′ LTR 中 U3 區域（即 ΔU3），使得整合后的病毒難以再次啟動(dòng)轉錄，進(jìn)一步降低安全風(fēng)險。該設計顯著(zhù)減少了生成 RCL 的可能性，廣泛應用于臨床前研究與 CAR-T 等基因治療研發(fā)中，盡管其操作復雜、產(chǎn)物滴度相對較低。

       第四代慢病毒載體：當前對于第四代慢病毒載體并無(wú)統一定義，且在研究中應用較少。Oxford推出了其TetraVecta?，將其稱(chēng)為第四代慢病毒載體體系，并且基于其開(kāi)發(fā)了新型的in vivo CAR-T的體系，將包膜蛋白替換為尼帕病毒包膜，感興趣的同學(xué)可以查閱其近期發(fā)表在Molecular Therapy的論文https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.07.006。

       通過(guò)上面的慢病毒載體發(fā)展路徑可以得知，優(yōu)化的方向是為了獲得更強的感染能力、宿主廣泛（分裂和非分裂細胞）、能夠整合進(jìn)宿主DNA且篩選后穩定遺傳、表達潛伏期短、更低的免疫原性、更高的生產(chǎn)滴度、更高的安全性。

       同時(shí)，Paul-Ehrlich-Institut分子生物技術(shù)和基因治療研究小組負責人Christian Buchholz在20年前就有了早期的靈感?；?005年發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上的一項研究（溶瘤病毒麻疹病毒通過(guò)引入編碼靶向腫瘤特異性CD38、EGFR和EGFRvIII的單鏈抗體的基因，有效進(jìn)入腫瘤細胞，實(shí)現了定向的抗腫瘤作用），Buchholz想知道一個(gè)類(lèi)似的策略是否可以幫助慢病毒載體進(jìn)入特定的細胞類(lèi)型。與期望相符，他在2008年報告稱(chēng)，CD20靶向的慢病毒載體優(yōu)先被B細胞"吸收"；2012年，其研究又證實(shí)，CD8靶向載體能夠進(jìn)入T細胞。但要將慢病毒載體轉化為藥物，需要強有力的有效載荷。隨著(zhù)殺傷B細胞的CAR-T細胞療法在2010年首次進(jìn)入臨床，Buchholz看到了機會(huì )。2018年，他發(fā)表最新成果研究顯示，利用慢病毒載體CD8‐LV（特異性靶向人類(lèi)CD8細胞）能夠直接在體內產(chǎn)生人類(lèi) CD19‐CAR T細胞，并導致CD19 B細胞清除。

       一些biotech開(kāi)始嘗試開(kāi)發(fā)這一策略，并逐漸做出一些調整，包括細胞靶向片段的選擇、治療載荷的選擇等。但其中還面臨一些其他的問(wèn)題需要解決。

       我們知道，慢病毒感染細胞主要是通過(guò)VSV-G/LDL-R通路實(shí)現的，LDL-R幾乎在絕大多數細胞上都有表達，這就表明慢病毒具有泛嗜性特征，但是在EX VIVO CAR-T的工藝中，因為感染都得分選富集后的T細胞，所有慢病毒得泛嗜性特征不會(huì )帶來(lái)脫靶等風(fēng)險。但在IN VIVO CAR-T平臺中，如果不解決泛嗜性問(wèn)題，直接回輸慢病毒這個(gè)終產(chǎn)品，其安全性風(fēng)險將無(wú)疑是巨大的。目前解決慢病毒泛嗜性的通常做法是2類(lèi)：

       1．是針對VSV-G進(jìn)行基因突變，使其降低/失去和LDL-R結合的能力，比如EsoBiotec在I331E位點(diǎn)進(jìn)行突變、Interius在I182E/T214N/T352A位點(diǎn)進(jìn)行突變、Kelonia在K47Q/R354A位點(diǎn)進(jìn)行了突變、Vyriad等企業(yè)用的是這個(gè)策略。這個(gè)策略的好處是依然采用了有大量的數據驗證的VSV-G， 但是因為VSV-G蛋白和LDL-R結合的點(diǎn)位非常有限，所以留給后來(lái)者進(jìn)行突變的機會(huì )，其實(shí)越來(lái)越少，在后續的產(chǎn)品中，是否會(huì )產(chǎn)生專(zhuān)利風(fēng)險，值得關(guān)注。

       2．是篩選新的假型蛋白，比如Umoja采用了Cocal-V-G假型蛋白、Oxford采用的NiV GM△34+F△22體系、易慕峰生物采用了MxV-G假型蛋白并對其突變的策略。這個(gè)策略好處是差異化的技術(shù)平臺未來(lái)會(huì )更有可能得到大的交易機會(huì )，無(wú)知識產(chǎn)權風(fēng)險、更大的改造空間；挑戰在于能否篩到合適的新的假型蛋白，并且找到適合的突變位點(diǎn)，新的新的假型蛋白數據少，科學(xué)性上需要更多的驗證。

       相信聊到這樣，就會(huì )有人提問(wèn)了，慢病毒既然失去了與LDL-R結合的能力，也就失去了感染細胞的能力，如何實(shí)現精準的靶細胞感染呢?這里就需要采用增加T細胞靶向模塊，常用的細胞靶向模塊的有:

       1.靶向非激活型T細胞的策略: 主要靶向CD7+T細胞，比如Interius

       針對非激活型 T細胞的策略，主要聚焦于識別 CD7 陽(yáng)性的靜息狀態(tài) T細胞，例如 Interius BioTherapeutics 所開(kāi)發(fā)的 INT2104。該療法利用工程化的慢病毒載體，通過(guò)靜脈注射直接靶向 CD7?的 T細胞和 NK細胞，將 CAR 基因傳遞至目標細胞，在體內原位生成 CAR T 和 CAR NK細胞，實(shí)現對 CD20? B 細胞惡性腫瘤的打擊。值得一提的是，Interius 在 2024 年 7 月已獲得澳大利亞人類(lèi)研究倫理委員會(huì )（HREC）批準，啟動(dòng)其首個(gè)人體 I 期臨床試驗。感興趣的同學(xué)可以參考其發(fā)表在Molecular Therapy的論文，該論文對其產(chǎn)品設計有詳細的描述，鏈接如下：Targeted in vivo delivery of genetic medicines utilizing an engineered lentiviral vector platform results in CAR T and NK cell generation - PubMed。

       靶向激活型的策略:主要靶向CD3+T細胞，比如Kelonia、EsoBiotec、Umoja等，其次，針對激活型 T 細胞的策略則主要利用 CD3或TCR等分子為靶點(diǎn)進(jìn)行T細胞的激活和轉導。該領(lǐng)域的BD/收購交易明顯更為活躍。Umoja Biopharma 的 UB-VV111，基于其 VivoVec? 平臺，可識別并通過(guò)CD3/CD80/CD58三重信號分子激活T細胞，在體內直接遞送 CAR 基因完成CAR-T 的原位生成。Umoja 成為了目前唯一一家獲得FDA IND 批準的公司。此外，此領(lǐng)域中另一個(gè)亮眼案例是 EsoBiotec 最近在《柳葉刀》（The Lancet）上發(fā)表了其 in vivo CAR-T 候選藥 ESO-T01 的臨床早期數據。該研究報道首批接受該療法的四位多發(fā)性骨髓瘤患者中，有兩位達到了嚴格完全緩解（sCR），其他兩位取得了部分緩解，并且骨髓檢測在第 28 天即顯示微小殘留?。∕RD）陰性。這些病人接受的劑量?jì)H為2×10^8 TU，卻展現了顯著(zhù)的療效，顯示出 EsoBiotec 的ENaBL 平臺的巨大潛力。不過(guò)需要指出的是，該臨床試驗也顯示出與傳統CAR-T療法不一樣不良反應譜，且更為快速和嚴重，其產(chǎn)品或臨床方案仍需持續優(yōu)化。感興趣的同學(xué)可以參考其發(fā)表在柳葉刀的論文，鏈接如下：In-vivo B-cell maturation antigen CAR T-cell therapy for relapsed or refractory multiple myeloma - PubMed。

       對于T細胞的轉染，特別是靜息態(tài)T細胞的轉染與激活能力，是IN VIVO CAR-T取得療效的重要基礎，未來(lái)病毒載體公司的療效差異可能很大一部分原因就是來(lái)自于該模塊。所以對于該指標更要認真、全面的評估和審查。

       病毒作為外來(lái)物，回輸體內以后，會(huì )被機體的先天免疫系統和補體系統識別和吞噬等，這樣對于最終的療效會(huì )帶來(lái)巨大的影響，為此各個(gè)公司也都做了不同的"盾牌"設計和優(yōu)化，比如Esobiothec,對MHC-I進(jìn)行了敲除和增加了CD47的過(guò)表達。這樣的盾牌涉及對于產(chǎn)品的穩定表達到底帶來(lái)怎么的效果，任需要持久的觀(guān)察。

       暢想未來(lái)，IN VIVO帶來(lái)巨大的想象力，同時(shí)也必須要清醒的認識到，這個(gè)平臺剛剛起步，仍有很多問(wèn)題需要回答，比如：

•        各載體轉染哪些細胞才能實(shí)現與EX-VIVO細胞產(chǎn)品相當的治療?

•        持續的轉基因表達對于臨床療效是否必要？，特別是對于腫瘤學(xué)或者非腫瘤學(xué)的應用?

•        不同組織和細胞類(lèi)型中脫靶CAR表達的后果(毒性/病理學(xué))是什么?

•        不同載體的先天免疫原性如何影響干細胞活性、抗原呈遞細胞激活并調節連續給藥方案中的反應原性？

•        EX-VIVO細胞設計的CAR結構域是否是IN VIVO細胞治療的最佳選擇?

•        什么給藥途徑可以最大限度地提高所需細胞類(lèi)型中的CAR 表達并最大限度地減少脫靶表達或先天免疫激活？

•        想要轉導/轉染哪些細胞類(lèi)型?使用具有多種免疫譜系趨向性的配體靶問(wèn)是否可以增強治療效果?且不同的靶向分子對副作用和療效的影響是什么?

•        IN VIVO細胞療法是否可以更好地動(dòng)員內激性免疫細胞類(lèi)型來(lái)引發(fā)廣泛的適應性抗腫瘤免疫反應?

•        IN VIVO 細胞療法帶來(lái)新的毒性譜是否有臨床處理預案？

       《百年孤獨》里說(shuō)："世界新生伊始，許多事物還沒(méi)有名字，提到的時(shí)候尚需要指指點(diǎn)點(diǎn)"，IN VIVO似乎正式這樣的狀態(tài)和階段。所以，相信相信的力量，一起靜待IN VIVO平臺的崛起。

       引用：醫藥魔方、Nature reviews、Expert Opin Biol Ther. 2013 Jul;13(7):987-1011. doi:10.1517/14712598.2013.779249.