摘要：在生物制藥產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的今天，重組治療性蛋白（如抗體）的高效生產(chǎn)成為關(guān)鍵。哺乳動(dòng)物細胞因能模擬人類(lèi)細胞的翻譯后修飾（如糖基化），成為生產(chǎn)這類(lèi)蛋白的核心 "細胞工廠(chǎng)"，其中中國倉鼠卵巢（CHO）細胞和人胚腎 293（HEK293）細胞應用最廣。與需要長(cháng)期篩選的穩定基因表達（SGE）系統不同，瞬時(shí)基因表達（TGE）系統憑借 "短周期、易操作" 的優(yōu)勢，成為生物藥早期研發(fā)的重要工具。本文系統梳理了 TGE 系統的組成，詳解了細胞系改造、表達載體工程、培養基優(yōu)化、轉染條件篩選、輔助基因共表達等關(guān)鍵優(yōu)化策略，結合最新研究數據說(shuō)明如何提升重組蛋白的產(chǎn)量與質(zhì)量，為產(chǎn)業(yè)界提供從實(shí)驗室到規?；a(chǎn)的實(shí)用參考。

       一、引言：生物制藥的 "細胞工廠(chǎng)" 與瞬時(shí)表達的獨特價(jià)值

       全球生物制藥市場(chǎng)規模正以驚人速度擴張，預計 2024 年將達到 3.89 億美元，其中重組治療性蛋白是核心組成部分。這類(lèi)蛋白的生產(chǎn)依賴(lài)于合適的表達系統，細菌、酵母、植物雖各有應用，但哺乳動(dòng)物細胞因能進(jìn)行復雜的翻譯后修飾（PTMs）-- 尤其是與人類(lèi)細胞相似的糖基化，成為生產(chǎn)抗體等復雜蛋白的首選。

       在眾多哺乳動(dòng)物細胞中，CHO 細胞堪稱(chēng) "王牌選手"：全球 89% 的哺乳動(dòng)物細胞來(lái)源生物藥由它生產(chǎn)。這得益于它能合成復雜結構蛋白、可大規模培養且不易受病毒感染的特性。HEK293 細胞則以 "生長(cháng)快、轉染效率高" 著(zhù)稱(chēng)，在懸浮無(wú)血清培養中表現優(yōu)異，常被用于藥物發(fā)現和毒性測試。

       哺乳動(dòng)物細胞的表達系統分為兩類(lèi)：穩定基因表達（SGE）和瞬時(shí)基因表達（TGE）。SGE 需要篩選穩定整合目的基因的細胞株，周期長(cháng)達數月；而 TGE 無(wú)需復雜篩選，直接將目的基因（GOI）導入細胞，2-4 周就能實(shí)現從基因克隆到蛋白表達（產(chǎn)量從毫克到克級），尤其適合早期研發(fā)和快速驗證（圖 1）。不過(guò)，TGE 的產(chǎn)量目前仍低于 SGE，如何突破這一瓶頸，正是本文要探討的核心。

       二、瞬時(shí)基因表達（TGE）系統的核心組成

       TGE 系統的高效運行，依賴(lài)于 "細胞系、表達載體、培養基" 三大核心要素的協(xié)同作用。

       （一）細胞系：生產(chǎn)蛋白的 "種子"

       目前 TGE 系統中最常用的是 CHO 和 HEK293 細胞，它們各自衍生出多個(gè)亞型，適配不同的生產(chǎn)需求：

       CHO 細胞：源自中國倉鼠卵巢組織，已開(kāi)發(fā)出 CHO-S、CHO DG44、GS 敲除 CHO 等亞型。其中 CHO-S 生長(cháng)快速，適合懸浮培養；GS 敲除型通過(guò)谷氨酰胺合成酶篩選，能穩定表達目的蛋白。

       HEK293 細胞：源自人胚腎細胞，亞型包括 293E、293T、293F 等。293F 在無(wú)血清懸浮培養中可達到高細胞密度，轉染效率高，是 TGE 的 "?？?quot;。

       不過(guò)，HEK293 細胞也有局限：生產(chǎn)的蛋白糖基化結構與人類(lèi)細胞存在差異，且易受人類(lèi)病毒污染，限制了其臨床應用。

       （二）表達載體：攜帶目的基因的 "運輸車(chē)"

       表達載體是攜帶目的基因進(jìn)入細胞的 "工具"，其核心是調控元件，包括啟動(dòng)子、增強子、終止子等，直接影響蛋白表達效率。例如：

       啟動(dòng)子：像 "開(kāi)關(guān)" 一樣啟動(dòng)基因轉錄，人類(lèi)巨細胞病毒（hCMV）啟動(dòng)子是常用的 "強開(kāi)關(guān)"，能高效驅動(dòng)抗體等蛋白的表達。

       輔助蛋白元件：若載體攜帶 EB 病毒核抗原 1（EBNA-1）或大 T 抗原基因，可幫助目的基因在細胞內穩定存在，提升 TGE 效率。

       （三）培養基：細胞生長(cháng)的 "營(yíng)養餐"

       培養基為細胞提供營(yíng)養，其成分直接影響細胞活力和蛋白產(chǎn)量。早期培養基需添加 10%-20% 血清，但血清成分復雜、易污染，給下游純化帶來(lái)麻煩。如今，無(wú)血清培養基（SFM）成為主流：它用明確成分的血清替代物組成，不僅消除了血清干擾，還降低了生產(chǎn)成本，是規?；a(chǎn)的 "標配"。

       三、TGE 系統的優(yōu)化策略：從細節突破產(chǎn)量瓶頸

       要提升 TGE 的效率，需從細胞、載體、培養條件等多維度優(yōu)化。以下是經(jīng)過(guò)實(shí)驗驗證的關(guān)鍵策略（圖 2）。

       （一）細胞系改造：讓 "細胞工廠(chǎng)" 更高效

       通過(guò)基因編輯或工程化改造細胞，可增強其抗凋亡能力、提升蛋白合成效率。

       敲除凋亡基因：細胞在培養中會(huì )因壓力凋亡，影響蛋白產(chǎn)量。研究發(fā)現，敲除 CHO-K1 細胞的凋亡基因 Bax 和 Bak 后，抗體滴度提升了 3-4 倍；過(guò)表達抗凋亡基因 Bcl-xL，CHO-DG44 細胞的融合蛋白產(chǎn)量增加 70%-270%，且細胞活力能維持在 90% 以上。

       增強蛋白折疊能力：蛋白在細胞內折疊錯誤會(huì )導致產(chǎn)量下降。若讓 CHO 細胞過(guò)表達未折疊蛋白反應因子（如 XBP-1S）或內質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（ERO1-La），可幫助蛋白正確折疊，抗體產(chǎn)量能提升 5.3-6.2 倍。

       亞型篩選：ExpiCHO-S?和 Expi293F 等工程化亞型表現突出。Expi293F 在懸浮培養中能達到高細胞密度，轉染后蛋白表達量比普通 293 細胞高 3-4 倍，尤其適合需要復雜修飾的蛋白生產(chǎn)。

       （二）表達載體工程：讓 "運輸車(chē)" 更能裝

       優(yōu)化載體的調控元件，可顯著(zhù)提升目的基因的轉錄和翻譯效率。

       啟動(dòng)子優(yōu)化：雙啟動(dòng)子載體（如同時(shí)攜帶兩個(gè) hCMV 啟動(dòng)子）比傳統單啟動(dòng)子或雙順?lè )醋虞d體更高效，在 CHO 細胞中抗體產(chǎn)量提升 1.4-1.9 倍。此外，cumate 基因開(kāi)關(guān)啟動(dòng)子（CR5）的效率是 hCMV 啟動(dòng)子的 3-4 倍，堪稱(chēng) "超強開(kāi)關(guān)"。

       順式作用元件：這些元件像 "助推器" 一樣增強基因表達。例如，泛染色質(zhì)開(kāi)放元件（UCOE）能防止基因被沉默，使抗體產(chǎn)量提升 1.5 倍；將 WPRE（ woodchuck 肝炎病毒轉錄后調控元件）與內含子 A 等元件組合，可使蛋白表達量提升 10.5 倍。

       信號肽優(yōu)化：信號肽負責引導蛋白分泌到細胞外，選對信號肽能提升分泌效率。人類(lèi)白蛋白和天青殺素來(lái)源的信號肽表現最佳，在 CHO 細胞中可使蛋白產(chǎn)量提升 1.5-2 倍；甚至可通過(guò)計算機設計 "定制信號肽"，例如針對難表達的單抗，定制信號肽能使產(chǎn)量提升 2.5 倍。

       （三）培養基與培養工藝：為細胞 "量身定制" 生長(cháng)環(huán)境

       培養基成分和培養條件的細微調整，能大幅提升細胞活力和蛋白產(chǎn)量。

       培養基添加物：

•        蛋白胨（含肽和氨基酸）是 "營(yíng)養強化劑"，在 CHO-DG44 細胞中添加后，TGE 產(chǎn)量提升 37%；小麥蛋白胨可使細胞生長(cháng)增加 30%，干擾素 -γ 產(chǎn)量提升 60%。

•        二甲基亞砜（DMSO）和醋酸鋰（LiAc）能幫助蛋白折疊，減少聚集。在 CHO 細胞中添加后，抗體產(chǎn)量可達 80mg/L；HEK293 細胞在轉染后 4 小時(shí)添加 10% DMSO，蛋白表達量提升 1.6 倍，且無(wú)明顯毒性。

       培養工藝優(yōu)化：

•        溫和低溫培養：細胞在 37℃快速生長(cháng)后，轉至 32-33℃培養，可使蛋白產(chǎn)量提升 1.5-6.2 倍。這是因為低溫能讓細胞停留在 G1/G0 期，減少分裂能耗，專(zhuān)注于蛋白合成，同時(shí)還能增強內質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力。

•        光照調控：通過(guò) CRISPR-dCas9 光控系統（LACE），可在光照下激活基因表達，使 eGFP（綠色熒光蛋白）的 TGE 產(chǎn)量提升 4 倍，實(shí)現 "按需生產(chǎn)"。

       （四）轉染條件優(yōu)化：讓目的基因 "精準進(jìn)入" 細胞

       轉染是將目的基因導入細胞的關(guān)鍵步驟，優(yōu)化試劑、比例和操作能提升效率。

       轉染試劑選擇：聚乙烯亞胺（PEI）是常用試劑，25kDa 線(xiàn)性 PEI 能使 CHO 細胞的抗體產(chǎn)量提升 2 倍；超支化聚賴(lài)氨酸（HBPL）無(wú)需預孵育，在含血清培養基中也能高效轉染，產(chǎn)量媲美甚至超過(guò) PEI。

       試劑比例：PEI 與 DNA 的比例（w/w）為 3:1 時(shí)，轉染效率最高（60%-66.93%）；在 Bax/Bak 雙敲除 CHO 細胞中，當比例為 5:1 時(shí)，抗體產(chǎn)量提升 3-4 倍。

       輔助方法：電穿孔結合抑制劑處理（如丁酸鈉），可使 CHO 細胞的熒光強度提升 4.8 倍；質(zhì)粒 DNA 經(jīng) 72℃加熱 30 分鐘，能提升 HEK293T 細胞的轉染效率，可能與去除雜質(zhì)有關(guān)。

       （五）輔助基因共表達：為蛋白生產(chǎn) "搭把手"

       共表達某些輔助基因，可增強細胞活力、促進(jìn)目的基因表達或蛋白折疊。

       抗凋亡與增殖基因：共表達 Bcl-xL 能減少細胞凋亡，使 CHO 細胞的蛋白產(chǎn)量提升約 2 倍；EBNA-1 與多瘤病毒大 T 抗原（PyLT）共表達，可使 CHO 細胞的特異性生產(chǎn)力（qP）提升 22.9 倍，因為它們能幫助目的基因在細胞內穩定存在。

       microRNA（miRNA）調控：miR-17 和 miR-92a 能促進(jìn) CHO 細胞生長(cháng)，使蛋白產(chǎn)量提升 3 倍；抑制 miR-7 則能減少細胞凋亡，讓分泌型堿性磷酸酶（SEAP）的產(chǎn)量翻倍。

       蛋白折疊輔助因子：共表達親環(huán)蛋白 B（CypB）與 SP35Fc 融合蛋白（比例 5:1），可消除蛋白聚集，使產(chǎn)量提升 6 倍，且產(chǎn)物更純凈。

       四、優(yōu)化效果匯總：數據見(jiàn)證突破

       不同優(yōu)化策略的效果可通過(guò)細胞密度、產(chǎn)量和特異性生產(chǎn)力（qP）直觀(guān)體現（表 1）。例如，細胞系改造中，ExpiCHO-S?能使產(chǎn)量提升 2.5-6 倍；載體工程中，CR5 啟動(dòng)子的效率是 hCMV 的 3-4 倍；培養基優(yōu)化中，小麥蛋白胨使 CHO-K1 細胞的產(chǎn)量提升 1.6 倍；輔助基因共表達中，EBNA-1 與 NDPK-A 組合能使產(chǎn)量提升 1.75-2.5 倍。這些數據證明，多策略聯(lián)合使用（如細胞改造 + 低溫培養 + 輔助基因共表達）能實(shí)現 "1+1>2" 的效果。

       五、總結與展望

       TGE 系統憑借短周期、易操作的優(yōu)勢，已成為生物藥早期研發(fā)的核心工具。通過(guò)細胞系改造、載體工程、培養基優(yōu)化等策略，其蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量已大幅提升，但仍面臨批間差異、規?；a(chǎn)效率不足等挑戰。

       未來(lái)，結合組學(xué)技術(shù)（基因組、轉錄組）和人工智能數據分析，有望精準找到影響 TGE 的關(guān)鍵因素，設計出 "量身定制" 的優(yōu)化方案。例如，通過(guò) AI 預測最佳培養基成分或轉染條件，進(jìn)一步縮短研發(fā)周期、降低成本?？梢灶A見(jiàn)，隨著(zhù)技術(shù)的突破，TGE 系統將在生物制藥產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮更大作用，加速更多創(chuàng )新藥從實(shí)驗室走向臨床。