自 CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，人們?yōu)橥卣蛊鋺梅秶冻隽舜罅颗?，從而開(kāi)發(fā)出了堿基編輯器（Base editor，BE）和先導編輯器（Prime editor，PE）。
堿基編輯器能夠轉換單個(gè)或少數幾個(gè)堿基，而先導編輯器能夠引入堿基替換以及小的片段插入和缺失。由于其靈活性和精準性，先導編輯器在包括細胞和基因治療以及疾病建模在內的治療應用方面正受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，先導編輯器受限于其較低的編輯效率，因此，人們探索了各種策略以提高先導編輯效率。
2025 年 8 月 5 日，首爾國立大學(xué)醫學(xué)院的研究人員在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Cell 上發(fā)表了題為：AI-generated MLH1 small binder improves prime editing efficiency 的研究論文。
該研究利用 David Baker 團隊開(kāi)發(fā)的 AI 蛋白質(zhì)設計工具--RFdiffusion，設計了靶向抑制錯配修復（MMR）通路的 MLH1 小型結合蛋白（MLH1-SB），并使用 AlphaFold3 從設計的候選蛋白中高效篩選最佳蛋白--一個(gè)僅由 82 個(gè)氨基酸組成的 MLH1-SB，其可與當前的各種先導編輯器兼容適配，在人類(lèi)細胞和小鼠體內大幅提高先導編輯效率。
這項研究凸顯了生成式人工智能（generative AI）在推進(jìn)基因組編輯技術(shù)方面的巨大潛力。
PE2 是一種優(yōu)化的 PE 架構，由融合了逆轉錄酶（RT）的 Cas9 切口酶（nCas9）組成，可在目標位點(diǎn)合成包含所需編輯的 DNA 鏈。此過(guò)程依賴(lài)于作為逆轉錄模板的先導編輯向導 RNA（pegRNA）的 3' 端延伸。為了提高 PE 的效率，PE3 和 PE5 采用了一種額外的切口向導 RNA（ngRNA），在未編輯的鏈上制造第二個(gè)切口，使懸突平衡（flap equilibrium）向期望的編輯方向偏移。
進(jìn)一步的研究表明，細胞中固有的錯配修復（MMR）途徑會(huì )阻礙在目標位點(diǎn)上所需編輯的整合。在錯配修復中，MutS 同源物（MutSα 由 MSH2-MSH6 組成，MutSβ 由 MSH2-MSH3 組成）識別錯配，并招募 MutLα 復合物（由 MLH1 和 PMS2 組成）以促進(jìn)修復。
因此，抑制關(guān)鍵的錯配修復組分（例如 MSH2、MSH3、MSH6、MLH1 和 PMS2）可顯著(zhù)提高 PE 效率?；谶@一點(diǎn)，PE4 通過(guò)同時(shí)遞送 MLH1dn 蛋白（用于移植 MutLα 復合物）和先導編輯器，以提高 PE 效率。然而，近期的研究顯示，只有對大約 10 bp 或更小片段的編輯時(shí)，抑制 MMR 途徑才能提高 PE 效率。
為了進(jìn)一步提高 PE 效率，在 pegRNA 的 3' 末端引入了 RNA 假結結構基序，以增強其穩定性并防止 3' 末端延伸部分的降解。此外，利用噬菌體輔助連續進(jìn)化技術(shù)（PACE）進(jìn)行蛋白質(zhì)進(jìn)化，已開(kāi)發(fā)出多種 PE6 架構，其編輯效率得到了提高。
此外，還有研究使用小 RNA 結合外切核酸酶保護因子 La 來(lái)保護 pegRNA 的 3' 端，從而開(kāi)發(fā)了效率更高的 PE7。
盡管上述研究在提高先導編效率術(shù)方面取得了許多進(jìn)步，但其編輯效率仍不盡如人意，尤其是在治療應用方面。此外，重要的是要在不使用切口向導 RNA（ngRNA）的情況下改進(jìn)先導編輯結構，因為 ngRNA 可能會(huì )引入意外的插入/缺失突變。
近年來(lái)，人工智能（AI）技術(shù)的進(jìn)步使得基于序列的蛋白質(zhì)結構預測以及蛋白質(zhì)的從頭設計成為可能。而且，AI 技術(shù)已被應用于開(kāi)發(fā)基于 CRISPR 基因編輯工具。
但 AI 驅動(dòng)的 CRISPR 基因組編輯改進(jìn)，主要集中在提高關(guān)鍵酶（例如核酸酶 Cas9 和 脫氨酶 TadA）的催化活性上。此外，諾獎得主、蛋白質(zhì)設計先驅 David Baker 開(kāi)發(fā)的 用于設計結合蛋白的 AI 工具--RFdiffusion，很大程度上僅限于設計單結合位點(diǎn)結合蛋白以及抗體。
在這項最新研究中，研究團隊利用 RFdiffusion 來(lái)抑制錯配修復（MMR）通路，從而提高先導編輯（PE）效率。
這是通過(guò)兩步策略實(shí)現的：1）從頭設計具有多個(gè)結合位點(diǎn)的全新蛋白質(zhì)，包括一個(gè)非競爭性錨定位點(diǎn)、一個(gè)靶向關(guān)鍵活性的抑制位點(diǎn)以及一個(gè)單純的競爭性結合位點(diǎn)；2）采用基于 AlphaFold3 的篩選系統來(lái)挑選最佳候選蛋白質(zhì)。
通過(guò)這種方法，研究團隊利用 RFdiffusion 生成了一系列 MLH1 的小型結合蛋白--MLH1-SB，顯著(zhù)提高了 PE 效率，并且與現有的 PE 架構兼容，包括 PE2、PEmax、PE6 和 PE7。
在這些生成的 MLH1-SB 中，研究團隊從中確定了一個(gè)僅由 82 個(gè)氨基酸組成的最優(yōu) MLH1-SB，其緊湊的結構使其能夠無(wú)縫整合到現有的 PE 架構（PEmax、PE6 和 PE7）中，從而開(kāi)發(fā)出諸如 PEmax-SB、PE6-SB 和 PE7-SB 這樣的 PE-SB 平臺。相比之下，MLH1dn 蛋白的多達 753 個(gè)氨基酸，體積龐大，難以整合和遞送。
值得注意的是，PE7-SB2 系統通過(guò)融合了兩個(gè) MLH1-SB，在人類(lèi)細胞中表現出顯著(zhù)提高的 PE 效率，分別比 PEmax 和 PE7 提高了約 18.8 倍和 2.5 倍。此外，體內研究顯示，在小鼠體內，PE7-SB2 的 PE 效率相比 PE7 提高了約 3.4 倍。
鑒于腺相關(guān)病毒（AAV）和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等體內基因治療遞送方法的有效載荷能力，該研究中通過(guò) AI 從頭設計并生成的 MLH1-SB 能夠在保持最小尺寸的同時(shí)顯著(zhù)增強 PE 效率，預計將促進(jìn)高效的體內基因編輯療法的開(kāi)發(fā)。
該研究的亮點(diǎn)：
RFdiffusion 生成的 MLH1 小型結合蛋白（MLH1-SB）抑制錯配修復活性；
AlphaFold 3 識別出有效的 MLH1 小型結合蛋白；
MLH1 小型結合蛋白可提高先導編輯效率且毒性有限；
MLH1 小型結合蛋白的緊湊尺寸使其能夠集成到先導編輯架構中。
最后，研究團隊表示，生成式人工智能（generative AI）工具的快速發(fā)展正在改變學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的研究格局。該研究中使用了便捷的網(wǎng)頁(yè)版 RFdiffusion，僅用 3 天時(shí)間就快速生成了 MLH1-SB，而且無(wú)需本地高算力支持，此外，使用 AlphaFold3 高效篩選蛋白，只用了 1 天時(shí)間，整個(gè)過(guò)程僅花費 4 天時(shí)間。這種高成功率、高效率，大大縮短了后續實(shí)驗所需的時(shí)間和成本。
論文鏈接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00799-8
合作咨詢(xún)
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國際展覽有限公司版權所有（保留一切權利）
滬ICP備05034851號-57
