抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的設計需要綜合考慮抗體、連接子、小分子毒素三個(gè)組成成分及它們之間的合理組合。其中抗體的選擇是 ADC 設計的起點(diǎn)，連接子與連接技術(shù)是決定 ADC 成藥性的關(guān)鍵因素，小分子藥物對于腫瘤細胞應具有高效的殺傷作用。ADC 藥物的設計也一直圍繞著(zhù)這三部分不斷發(fā)展。ADC 藥物的工藝包括了小分子的制備和抗體的制備，ADC 分析也相較于傳統生物制藥分析更為復雜，需要多種生物制藥研究和分析方法聯(lián)合使用。

       今天為大家解讀一篇關(guān)于A(yíng)DC藥物的CMC與表征概述的文章。主要圍繞第一代ADC藥物進(jìn)行闡述，通過(guò)了解第一代ADC的開(kāi)發(fā)可以讓我們站在巨人的肩膀上為新一代ADC研發(fā)提供思路。

       1.1 簡(jiǎn)介

       ADC從工藝和分析開(kāi)發(fā)的角度來(lái)看，其技術(shù)體系極為復雜。ADC通過(guò)規避細胞毒性的方式實(shí)現高效活性成分的靶向遞送，相比其單個(gè)分子組分能提供更優(yōu)越的治療指數，正成為該領(lǐng)域新興的解決方案。ADC產(chǎn)品的質(zhì)量與性能直接取決于生產(chǎn)工藝及其設計控制方式。本章將重點(diǎn)闡述第一代ADC的工藝開(kāi)發(fā)，以及這些工藝在新一代ADC中的延伸應用。

       1.2 ADC生產(chǎn)工藝

       ADC的開(kāi)發(fā)從充分表征的單克隆抗體（mAb）、連接子及細胞毒素原料開(kāi)始，依次經(jīng)歷mAb活化、偶聯(lián)、純化、制劑及臨床給藥儲存等步驟。圖1.1概括了第一代ADC產(chǎn)品的通用生產(chǎn)工藝流程。在整個(gè)過(guò)程中，ADC各組分（抗體、毒素和連接子）均會(huì )經(jīng)歷嚴苛的化學(xué)與物理環(huán)境（條件），這些條件有可能影響產(chǎn)品質(zhì)量，應進(jìn)行充分的控制。關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs，見(jiàn)表1.1）是ADC工藝的核心概念，需在整個(gè)流程中進(jìn)行全面監控以確保終產(chǎn)品的高質(zhì)量。監控CQAs的目的是根據質(zhì)量目標產(chǎn)品概況（QTPP）要求--包括安全性和有效性等特性--確保產(chǎn)品達到既定質(zhì)量標準。

       圖1.1 ADC的制造流程概覽

       表1.1 ADC關(guān)鍵質(zhì)量屬性（控制階段和影響）

       1.2.1 偶聯(lián)

       ADC的生產(chǎn)始于化學(xué)與生物起始原料，首先抗體與小分子偶聯(lián)生成ADC原液。從工藝規模來(lái)看，正是這一偶聯(lián)工藝環(huán)節使ADC產(chǎn)品開(kāi)發(fā)既不同于單抗藥物，也區別于小分子藥物開(kāi)發(fā)。該步驟需在支持活性化學(xué)反應條件下進(jìn)行，既要實(shí)現單抗的適度偶聯(lián)，又要避免起始原料發(fā)生顯著(zhù)降解或交叉反應。

       在進(jìn)入偶聯(lián)階段前，ADC工藝中的連接子、細胞毒素有效載荷和單抗中間體的生產(chǎn)與控制要求存在顯著(zhù)差異。此外，完成整個(gè)ADC制劑（DP）生產(chǎn)所需的設施需具備細胞毒素處理、活性化學(xué)反應、生物制品及高分子量蛋白質(zhì)操作等綜合能力。

       理想情況下，偶聯(lián)工藝及后續純化、制劑過(guò)程不應導致單抗與細胞毒素中間體產(chǎn)生新的降解或不穩定途徑。但事實(shí)上，相較于親本單抗，這一新分子實(shí)體本身穩定性降低，因此必須采取相應措施以最大限度減少這些不穩定因素。

       第一代ADC產(chǎn)品（Kadcyla?和Adcetris?）分別代表了基于賴(lài)氨酸和基于半胱氨酸的偶聯(lián)策略。Kadcyla?采用雙功能連接子SMCC（N-琥珀酰亞胺基-4-(馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯）：首先其琥珀酰亞胺基團與曲妥珠單抗的多個(gè)賴(lài)氨酸側鏈反應生成活化抗體，隨后SMCC連接子的馬來(lái)酰亞胺端基與DM1毒素上引入的巰基反應，最終形成完整偶聯(lián)物。

       以Adcetris?為例的基于巰基的偶聯(lián)工藝中，首先采用三(2-羧乙基)膦（TCEP）對鏈內二硫鍵進(jìn)行可控還原，在抗體活化階段產(chǎn)生游離巰基。隨后通過(guò)馬來(lái)酰亞胺功能化的連接子-載荷復合物（含蛋白酶可切割的纈氨酸-瓜氨酸連接子及MMAE毒素）對這些游離巰基進(jìn)行標記。與賴(lài)氨酸偶聯(lián)相比，半胱氨酸偶聯(lián)產(chǎn)生的偶聯(lián)產(chǎn)物分布更為均一。

       在賴(lài)氨酸與半胱氨酸偶聯(lián)過(guò)程中，均可能發(fā)生多種副反應。琥珀酰亞胺或馬來(lái)酰亞胺的反應活性在中性/堿性pH條件下增強，但該環(huán)境同時(shí)會(huì )促進(jìn)單抗發(fā)生脫酰胺反應、焦谷氨酸形成及蛋白質(zhì)聚集。偶聯(lián)工藝需避免親核試劑干擾，并通過(guò)精確的pH控制平衡化學(xué)反應活性與單抗穩定性。

       偶聯(lián)異質(zhì)性也可從競爭反應角度分析：賴(lài)氨酸或半胱氨酸側鏈的可及性及反應活性，既受整體溶液條件影響，也取決于單抗二級/三級結構中的局部微環(huán)境。由于這些微環(huán)境會(huì )隨單抗構象的細微變化而改變，單抗結構不穩定將直接影響偶聯(lián)異質(zhì)性和化學(xué)計量比。圖1.2展示了ADC分子在制造過(guò)程中承受的化學(xué)與物理作用力--根據工藝要求，單抗分子在活化與偶聯(lián)階段需接觸高溫、有機溶劑、還原劑及反應副產(chǎn)物。此外，在抗體活化與偶聯(lián)過(guò)程中還涉及緩沖液置換、濃度調節、色譜分離等多步中間操作。這些處理步驟雖然能實(shí)現ADC物質(zhì)的富集或分離，但均可能引發(fā)物理不穩定性。

       圖1.2 ADC產(chǎn)品在整個(gè)制造過(guò)程生命周期中的物理與化學(xué)作用力

       試劑的儲存、操作與質(zhì)量控制對實(shí)現穩定的偶聯(lián)反應至關(guān)重要。以常用還原劑TCEP為例，其雜質(zhì)含量或濃度偏差會(huì )導致游離巰基生成不足，進(jìn)而降低偶聯(lián)效率；連接子在運輸或儲存過(guò)程中若接觸濕氣，同樣可能造成不完全偶聯(lián)；而單抗的不當處理也會(huì )如前文所述影響偶聯(lián)效果。偶聯(lián)位點(diǎn)與化學(xué)計量比會(huì )顯著(zhù)影響ADC的療效與安全性特征，因此必須對這些關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行系統檢測。

       1.2.2 下一代偶聯(lián)化學(xué)

       當前，新一代偶聯(lián)化學(xué)技術(shù)的探索正在蓬勃開(kāi)展，旨在拓展ADC的治療應用范疇。這些突破或將深刻影響未來(lái)ADC的工藝發(fā)展方向。如表1.2所示，重點(diǎn)研發(fā)方向包括：新型有效載荷的開(kāi)發(fā)、替代性連接子技術(shù)的創(chuàng )新，以及能夠降低ADC異質(zhì)性的優(yōu)化生物偶聯(lián)策略。

       表1.2 新一代連接子-載荷及偶聯(lián)策略示例

       1.2.2.1 新型載荷的共軛

       在下一代ADC設計中，目前主要有四類(lèi)具有重要臨床意義的細胞毒素--盡管這些毒素對整體ADC開(kāi)發(fā)流程的影響差異不大。以Adcetris?（微管抑制劑奧瑞他汀類(lèi)）和Kadcyla?（美登素類(lèi)）為代表的微管蛋白抑制劑，以及基于DNA結合與嵌入機制的新型毒素。

       例如從棘孢小單孢菌中分離的天然產(chǎn)物卡奇霉素（calicheamicin），可通過(guò)結合DNA小溝并引發(fā)鏈斷裂發(fā)揮作用。這類(lèi)抗腫瘤物質(zhì)作為ADC細胞毒素已探索多年，首個(gè)獲批ADC藥物Mylotarg?（吉妥珠單抗奧佐米星）即采用該毒素。另一類(lèi)吡咯并苯二氮卓類(lèi)（PBDs）化合物同樣通過(guò)DNA小溝結合與交聯(lián)發(fā)揮作用。雖然這類(lèi)分子效價(jià)極高，但其強疏水性和光敏感性也帶來(lái)穩定性風(fēng)險。還有阿霉素等。（第一代ADC載荷）

       1.2.2.2 連接子的設計

       ADC連接子是一類(lèi)多功能分子，既能確保ADC的穩定遞送，又能實(shí)現細胞毒素載荷的靶向釋放。從ADC工藝與質(zhì)量控制的角度來(lái)看，連接子設計深刻影響著(zhù)偶聯(lián)反應條件及后續ADC產(chǎn)物的處理。這些分子既要提供連接細胞毒素與單抗的化學(xué)反應位點(diǎn)，又需具備可控釋放載荷的功能結構--當ADC被內化后，其骨架結構能觸發(fā)毒素釋放。這些功能要求帶來(lái)的技術(shù)挑戰推動(dòng)了該領(lǐng)域的廣泛研究，并對ADC開(kāi)發(fā)中的偶聯(lián)及下游工藝產(chǎn)生深遠影響。

       ADC連接子本質(zhì)上可分為不可切割型與可切割型兩大類(lèi)。相較于可切割連接子，Kadcyla?采用的SMCC不可切割型連接子，以及添加了聚乙二醇（PEG）間隔基，在工藝開(kāi)發(fā)和特性分析方面難度較低。而可切割連接子則利用酸不穩定的腙鍵、可還原的二硫鍵或蛋白酶敏感的肽段（如纈氨酸-瓜氨酸）來(lái)實(shí)現細胞內毒素釋放。

       從工藝與生產(chǎn)穩定性考量，必須對這些試劑進(jìn)行全程嚴格監控：包括偶聯(lián)階段前后的總純度、微量降解物，以及可能影響穩定性的各種因素。理想情況下，連接子切割應僅發(fā)生在細胞內。但事實(shí)上，ADC原藥在純化、制劑和凍干等下游工藝中，始終暴露于pH變化、溫度波動(dòng)、光照和空氣接觸等外部壓力，這些均可能導致游離藥物微量釋放，帶來(lái)全程毒性風(fēng)險。因此，所有下游生產(chǎn)環(huán)節都需采用全面且正交的分析方法，既要檢測游離藥物及其相關(guān)降解形式，更要監控ADC上連接子-載荷的脫落情況。

       以常見(jiàn)的硫代琥珀酰亞胺鍵為例（通過(guò)硫醇與馬來(lái)酰亞胺的邁克爾加成反應形成）：該鍵可能通過(guò)琥珀酰亞胺水解或逆邁克爾反應發(fā)生降解。雖然開(kāi)環(huán)水解產(chǎn)物不會(huì )導致載荷釋放，但會(huì )改變ADC的溶液電荷狀態(tài)；而逆邁克爾反應則會(huì )產(chǎn)生具有游離巰基反應活性的載荷形式，可能與其他可及巰基形成蛋白質(zhì)-藥物偶聯(lián)物。這種連接子降解途徑不僅會(huì )降低ADC生物活性，還可能引發(fā)毒性隱患。

       1.2.3 抗體工程

       基于硫醇或賴(lài)氨酸的連接子化學(xué)面臨的核心工藝挑戰在于偶聯(lián)異質(zhì)性，這種異質(zhì)性是整個(gè)ADC工藝的關(guān)鍵控制點(diǎn)，需要建立全面的質(zhì)量控制和深入的表征分析，以確保符合質(zhì)量目標產(chǎn)品概況（QTPP）標準。以Kadcyla?為例，其曲妥珠單抗分子上最多可分布8個(gè)載荷，這一數量主要由SMCC連接子的活化步驟決定；而Adcetris?則通過(guò)TCEP控制二硫鍵還原程度來(lái)精準調控藥物抗體比（DAR）。這兩種工藝都強調對反應條件（濃度、pH、溫度和時(shí)間）及起始物料質(zhì)量的嚴格控制，這些因素直接影響產(chǎn)品放行必須達標的DAR值，同時(shí)還需避免單抗本身的過(guò)度降解或結構破壞。

       若能獲得更均一的ADC分子，將大幅簡(jiǎn)化從偶聯(lián)到下游的整個(gè)生產(chǎn)工藝與表征流程。目前已有若干創(chuàng )新技術(shù)正在開(kāi)發(fā)中，表1.2列舉了部分代表性進(jìn)展，這些技術(shù)有望解決第一代ADC面臨的多種工藝挑戰。其優(yōu)勢包括：降低DAR相關(guān)的偶聯(lián)異質(zhì)性、減少未偶聯(lián)單抗殘留、改善載荷位點(diǎn)分布--所有這些特性均已被證實(shí)會(huì )影響ADC的治療窗和穩定性。此外，Fc功能與抗原結合親和力、體內穩定性與藥代動(dòng)力學(xué)特性、以及內化后載荷釋放效率等，也都與偶聯(lián)程度和位點(diǎn)密切相關(guān)。

       定點(diǎn)偶聯(lián)策略主要包括：工程化半胱氨酸殘基技術(shù)和通過(guò)優(yōu)化表達系統引入非天然氨基酸。前者仍存在游離巰基引發(fā)的風(fēng)險，可能形成分子內二硫鍵錯配，若巰基位點(diǎn)選擇不當會(huì )導致更嚴重的蛋白質(zhì)結構變化。另一種定點(diǎn)偶聯(lián)方法利用轉谷氨酰胺酶（一種能催化谷氨酰胺與賴(lài)氨酸側鏈成鍵的細菌酶，該酶可識別IgG恒定區工程化的谷氨酰胺標簽（LLQG），通過(guò)酶法或更優(yōu)的化學(xué)酶法策略可實(shí)現DAR值1-2的精確控制。

       這些技術(shù)都不可避免需要使用活性化學(xué)或生物化學(xué)方法將小分子連接子與細胞毒素連接到單抗上。在純化前的偶聯(lián)步驟中，抗體和連接子-載荷復合物會(huì )經(jīng)歷多種嚴苛條件，包括pH波動(dòng)（pH4-8）、高溫以及共溶劑（如二甲基亞砜DMSO、乙醇）處理。從工藝開(kāi)發(fā)角度看，始終存在副反應或降解風(fēng)險，最終可能影響偶聯(lián)收率。表1.2所述的若干新一代偶聯(lián)技術(shù)采用了單抗一級結構修飾、改造表達系統或非天然氨基酸等策略，但工程化單抗的體外和體內穩定性可能不及現有上市抗體藥物那樣明確可靠。

       1.2.4 純化

       在獲得符合預期組分和活性的偶聯(lián)抗體后，粗產(chǎn)物需經(jīng)過(guò)純化流程以去除大部分低分子量組分。根據偶聯(lián)方案的不同，在抗體活化與偶聯(lián)步驟之間可能還需進(jìn)行中間純化或緩沖液置換。ADC的純化通常采用透析過(guò)濾技術(shù)--該技術(shù)體系通過(guò)使粗產(chǎn)物與特定截留分子量的超濾膜接觸，在泵壓驅動(dòng)下使低分子量物質(zhì)透過(guò)膜孔，而主要含ADC的高分子量物質(zhì)則被截留。該工藝同時(shí)可實(shí)現ADC原液的緩沖液置換和濃度調整，使其更符合制劑要求。

       透析過(guò)濾存在多種形式，尤其體現在規模差異上：小規模操作可通過(guò)離心或負壓實(shí)現超濾，而工業(yè)化生產(chǎn)則采用切向流過(guò)濾（TFF）等連續流系統。雖然大規模TFF能為ADC原液提供更溫和的處理環(huán)境，但空氣接觸、反復界面作用及溫度波動(dòng)等因素仍會(huì )帶來(lái)穩定性風(fēng)險（參見(jiàn)圖1.2及表1.1/1.3），進(jìn)而影響ADC關(guān)鍵質(zhì)量屬性。相較于未偶聯(lián)的IgG分子，ADC因攜帶多個(gè)疏水性修飾基團而導致溶解性和穩定性下降，這要求其純化過(guò)程需采取更專(zhuān)業(yè)的處理措施。

       表1.3 ADC的穩定性特性及所采用的表征技術(shù)

       1.2.5 制劑處方

       ADC制劑開(kāi)發(fā)需實(shí)現雙重目標：在初步純化后產(chǎn)物穩定，并為后續凍干、復溶及靜脈給藥提供適宜載體。因此，制劑工藝是連接純化ADC分子與臨床使用產(chǎn)品的關(guān)鍵橋梁。在上市批準前，隨著(zhù)ADC產(chǎn)品標準的逐步確立，其制劑方案從臨床前到III期研究階段會(huì )持續優(yōu)化。盡早明確給藥途徑對工藝開(kāi)發(fā)至關(guān)重要--特別是在偶聯(lián)階段后，這將指導純化與制劑策略的制定。制劑作為ADC整體生產(chǎn)工藝的核心環(huán)節，其典型組成包括緩沖劑、糖類(lèi)和表面活性劑，這些組分共同維持ADC溶液的穩定性、凍干特性及復溶性能。

       相較于單抗制劑，ADC制劑存在兩個(gè)顯著(zhù)差異：其一，ADC濃度范圍（Adcetris?：5mg/mL，Kadcyla?：20mg/mL）通常低于常規單抗制劑，因此對降低粘度的輔料需求減少；其二，連接子-載荷的化學(xué)穩定性成為緩沖劑選擇和pH設定的關(guān)鍵考量因素。由于連接子-藥物組分引入的額外疏水性，制劑開(kāi)發(fā)中需重點(diǎn)監控聚集和構象不穩定性（參見(jiàn)圖1.2及表1.3）。對此必須采用正交分析和物化檢測技術(shù)，因為所觀(guān)察到的降解或不穩定現象高度依賴(lài)于分析方法。

       盡管存在這些差異，ADC的長(cháng)期穩定性評估仍可借鑒單抗與小分子藥物開(kāi)發(fā)積累的成熟技術(shù)體系。在質(zhì)譜等尖端分析技術(shù)蓬勃發(fā)展的今天，需注意這些方法的階段適用性。最終制劑開(kāi)發(fā)階段，穩定性指示方法必須具有長(cháng)期一致性和穩健性，以支持ADC制劑表征所需的對比穩定性研究，并確保在產(chǎn)品生命周期可能涉及的多產(chǎn)地生產(chǎn)時(shí)具備方法可轉移性。

       1.3 表征

       ADC產(chǎn)品的整體開(kāi)發(fā)高度依賴(lài)于其表征方法。本文概述了用于A(yíng)DC原液分析表征的技術(shù)體系，重點(diǎn)闡釋這些技術(shù)在A(yíng)DC開(kāi)發(fā)流程中的關(guān)鍵應用節點(diǎn)。我們將結合ADC生產(chǎn)工藝（圖1.1，表1.3）及相關(guān)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（表1.1），簡(jiǎn)要介紹質(zhì)量控制（QC）工具的應用框架。

       1.3.1 質(zhì)量與穩定性測試

       ADC表征的一個(gè)顯著(zhù)特點(diǎn)在于其活性分子固有的異質(zhì)性--即使是最純凈的狀態(tài)下，這種異質(zhì)性也遠超出起始單抗本身的翻譯后修飾復雜性。目前已獲批的ADC產(chǎn)品均存在連接子-載荷在個(gè)數和位點(diǎn)分布上的分布差異，這就要求從偶聯(lián)階段開(kāi)始就必須對這種化學(xué)異質(zhì)性進(jìn)行系統表征和控制。多個(gè)連接子-載荷基團的共價(jià)連接會(huì )改變起始單抗的溶液性質(zhì)，進(jìn)而影響產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和表征策略。如表1.3所總結，ADC開(kāi)發(fā)全過(guò)程必須進(jìn)行的表征包括：化學(xué)穩定性、構象穩定性、膠體穩定性及總體溶液穩定性。

       雖然現有多種分析技術(shù)可用于蛋白質(zhì)溶液特性研究，但那些能反映ADC關(guān)鍵質(zhì)量屬性、并提供穩定性指示數據的檢測方法才是ADC生產(chǎn)工藝的核心。表1.3同時(shí)標明了這些技術(shù)能解決的關(guān)鍵問(wèn)題及其典型應用階段。圖1.2和圖1.3則重點(diǎn)展示了在A(yíng)DC產(chǎn)品生命周期中必須控制的多種外界作用力及降解途徑。

       圖1.3 ADC在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中常見(jiàn)的降解途徑

       基于溶液的色譜與電泳技術(shù)是ADC開(kāi)發(fā)中質(zhì)量控制表征的核心手段。這些方法主要定量檢測化學(xué)純度與穩定性，也可部分反映構象穩定性。其中，尺寸排阻色譜（SEC）作為蛋白質(zhì)純化與分析的主要技術(shù)，能精準識別和定量由聚集形成的高分子量物質(zhì)。結合多角度光散射（MALS）檢測，SEC-MALS可監測ADC因載荷疏水性增加而導致的聚集傾向。即使低至1%的聚集水平（圖1.4a）也能通過(guò)SEC檢測，使其成為貫穿ADC生產(chǎn)流程的單抗穩定性重要指標。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）則能檢測更大粒徑的顆粒。

       疏水作用色譜（HIC）在A(yíng)DC表征中的應用日益廣泛，該技術(shù)通過(guò)檢測連接子-載荷數量增加導致的ADC分子疏水性變化（圖1.4b），可在常規HPLC或UPLC系統上實(shí)現定性定量的DAR分布分析，為質(zhì)量控制和穩定性評估提供關(guān)鍵數據。DAR值測定的正交方法紫外-可見(jiàn)光譜需依賴(lài)連接子或毒素上的合適發(fā)色團，但無(wú)法提供降解產(chǎn)物的分離信息。結合總蛋白分光光度檢測，HIC與UV-vis應共同構成半胱氨酸偶聯(lián)ADC的基礎QC方案。而賴(lài)氨酸偶聯(lián)ADC因異質(zhì)性更高，需采用LC-MS技術(shù)解析更多組分。ADC的LC-MS分析通常需要去糖基化和變性條件，但SEC-MS聯(lián)用技術(shù)可在非變性條件下進(jìn)行質(zhì)譜檢測（圖1.4c）。

       圖1.4 常用ADC表征技術(shù)示例數據。(a) ADC的SEC圖。(b) 半胱氨酸偶聯(lián)ADC的HIC檢測DAR值圖。(c) 完整賴(lài)氨酸偶聯(lián)ADC的SEC-MS質(zhì)譜分析圖。

       成像毛細管等電聚焦（iCIEF）通過(guò)pH梯度凝膠分離，全程監測單抗與ADC的電荷分布。如圖1.3所示，脫酰胺和賴(lài)氨酸截短（K缺失）等降解途徑會(huì )改變分子電荷分布特征。還原/非還原SDS用于檢測蛋白片段化。離子交換色譜（IEX）分析電荷態(tài)分布異質(zhì)性。HIC、SEC和IEX等色譜方法可在非變性條件下進(jìn)行，便于特定組分的分離制備或放大純化。

       反相HPLC主要用于細胞毒素和連接子衍生小分子的定量分析，常聯(lián)用MS提升靈敏度。鑒于毒性風(fēng)險，該分析對指導偶聯(lián)后純化至關(guān)重要，并能檢測原液與制劑中游離毒素水平，通過(guò)識別多種潛在降解產(chǎn)物提供穩定性指示。其色譜條件取決于連接子/毒素特性，相關(guān)方法開(kāi)發(fā)可借鑒連接子-藥物的CMC數據。此外，因偶聯(lián)中使用的DMSO/DMF等有機溶劑具有毒性，需通過(guò)氣相色譜進(jìn)行殘留檢測。

       1.3.2 生化與微生物檢測

       采用ELISA法檢測ADC與起始單抗的抗原結合效價(jià)，可驗證偶聯(lián)過(guò)程是否導致親和力下降。對于基于大腸桿菌或中國倉鼠卵巢（CHO）細胞表達系統的產(chǎn)品，已建立成熟的殘留雜質(zhì)定量方法：包括qPCR檢測宿主細胞DNA、ELISA法檢測宿主細胞蛋白等。這些單抗相關(guān)雜質(zhì)必須在偶聯(lián)前完成質(zhì)量控制。

       對于基于工程化半胱氨酸、非天然氨基酸或新型表達系統的下一代ADC分子，可能需重新優(yōu)化上述檢測方法。該原則同樣適用于工程化抗體的血漿穩定性及藥代動(dòng)力學(xué)-藥效學(xué)（PK-PD）特性評估--從表征角度而言，這類(lèi)新一代單抗分子本身可能需被視為全新分子實(shí)體進(jìn)行系統研究。

       1.3.3 其他表征

       如同治療性蛋白藥物的開(kāi)發(fā)，ADC原液或制劑也需進(jìn)行深入表征，以提供盡可能全面的特性鑒定、純度和穩定性信息，從而降低產(chǎn)品開(kāi)發(fā)整體風(fēng)險。為滿(mǎn)足完整上市申報要求，需采用科學(xué)論證方法體系來(lái)確保原液和制劑在其市場(chǎng)生命周期內的特性一致性和可比性可控。部分檢測方法雖不直接反映ADC穩定性，但能提供特性鑒定信息，例如氨基酸序列確證、連接子-藥物位點(diǎn)占據率、單抗翻譯后修飾特征以及偶聯(lián)/純化/制劑工藝引發(fā)的結構變化。反相高效液相色譜（RP-HPLC）肽圖分析作為蛋白藥物的常規指紋圖譜技術(shù)，在A(yíng)DC表征中占據重要地位。質(zhì)譜技術(shù)是偶聯(lián)活化和偶聯(lián)步驟中評估異質(zhì)性的關(guān)鍵手段。更全面的分子分析則需要采用LC-MS/MS等技術(shù)來(lái)確認氨基酸序列、單抗翻譯后修飾及化學(xué)修飾，氧化、脫酰胺等復雜修飾及糖鏈特征的精準鑒定。

       圓二色譜（CD）、紫外-可見(jiàn)光譜和熒光光譜等光譜技術(shù)正日益廣泛地用于研究單抗構象/膠體穩定性及其與溫度的相互作用。通過(guò)CD光譜可估算α螺旋和β折疊含量，既可對比初始單抗數據，也可通過(guò)長(cháng)期監測進(jìn)行穩定性評估。內源/外源熒光法已成功應用于化合物結合或制劑穩定性相關(guān)的二級/三級結構變化檢測。差示掃描量熱法（DSC）和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）等工具也正應用于A(yíng)DC熱力學(xué)研究。蛋白質(zhì)構象完整性喪失或膠體不穩定的起始點(diǎn)受制劑穩定性影響。這些方法最適用于A(yíng)DC原液純化后監測連接子-載荷對單抗構象的影響，在制劑優(yōu)化階段則可用于篩選穩定輔料。此類(lèi)方法提供的構象穩定性信息難以通過(guò)前述直接分子分析方法獲得。需注意的是，這些生物物理方法在A(yíng)DC表征和制劑優(yōu)化中的普適性，很大程度上取決于所用連接子/載荷的光學(xué)特性、干擾因素及制劑組分。

       1.4 可比性

       與所有已上市原料藥及制劑相同，必須證明ADC在整個(gè)生命周期內均能保持化學(xué)特性、藥理學(xué)特性及毒理學(xué)特性的一致性。從監管角度而言，可比性研究的核心目的是確認生產(chǎn)工藝的微小變更不會(huì )對制劑的安全有效性產(chǎn)生負面影響。這種理化特性與功能的一致性必須貫穿于原材料供應商變更、生產(chǎn)場(chǎng)地變更及檢測設備變更的全過(guò)程。實(shí)現可比性的前提是：首先在偶聯(lián)工藝前建立單抗與藥物/連接子材料的適當控制標準與驗收標準。根據FDA要求，單抗及藥物/連接子中間體需接受與終產(chǎn)品原料藥同等水平的全面表征。對于單抗中間體，這包括完整的結構、純度、穩定性及生物學(xué)活性評估，以確保當單抗生產(chǎn)發(fā)生變更時(shí)可進(jìn)行可比性判定。同理，偶聯(lián)用連接子/藥物分子也需完成結構/元素分析、雜質(zhì)譜分析及穩定性評估。隨后通過(guò)偶聯(lián)、純化及制劑階段的全面質(zhì)量控制與深度表征數據，建立與歷史批次或未來(lái)生產(chǎn)批次的可比性基礎?？杀刃栽u估與標準制定的復雜性不容低估--從早期臨床研究到產(chǎn)品上市期間將產(chǎn)生多個(gè)生產(chǎn)批次。ADC的可比性評估還存在額外復雜性：終產(chǎn)品由多個(gè)批次的單抗與連接子-藥物中間體共同構成。鑒于特定分析結果與安全有效性之間的關(guān)聯(lián)可能尚未完全闡明，ADC的可比性研究可能還需補充臨床與非臨床體內研究。

       1.5 結論

       ADC的生產(chǎn)融合了細胞毒性小分子藥物和單抗藥物開(kāi)發(fā)的諸多復雜性?？傮w而言，基于單抗的穩定性、偶聯(lián)異質(zhì)性以及這些關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）的表征，是ADC生產(chǎn)工藝和優(yōu)化開(kāi)發(fā)方法的核心考量因素。ADC表征技術(shù)的發(fā)展速度與新一代ADC的創(chuàng )新步伐同步。預計隨著(zhù)偶聯(lián)工藝的簡(jiǎn)化、ADC工藝認知的深入，以及階段適配的表征工具的應用，未來(lái)將催生更安全、更有效且更具成本效益的治療選擇。