引言

       抗體與其靶抗原的結合動(dòng)力學(xué)是決定其生物學(xué)功能和作為新型生物治療藥物成功的關(guān)鍵因素。定義抗原抗體的相互作用和動(dòng)力學(xué)對于理解抗體在治療應用中的藥理學(xué)和藥效學(xué)特征至關(guān)重要。

       抗體的功能與其結構直接相關(guān)，不同的結構域能夠與抗原和免疫系統的其他元件相互作用。天然抗體由兩個(gè)片段抗原結合結構域（Fab）和一個(gè)片段可結晶結構域（Fc）組成。Fab結構域包含互補決定區（CDR），其通過(guò)非共價(jià)相互作用介導抗體與靶標的結合。傳統上，兩個(gè)抗體臂上的CDR是相同的，但目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種新的形式，包括雙特異性抗體、三特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）和免疫細胞因子等。

       精準確定抗體結合相互作用是早期發(fā)現工作的關(guān)鍵，靶點(diǎn)的性質(zhì)和候選抗體的適應癥應用可能決定親和力要求和靶點(diǎn)作用機制。與小分子不同，抗體可以與幾個(gè)治療靶點(diǎn)（包括Fc受體）相互作用，導致免疫效應細胞的募集和激活，直接消除表達靶抗原的細胞?？贵w還可以通過(guò)模仿天然多價(jià)配體、驅動(dòng)受體聚集和反激活來(lái)誘導激動(dòng)作用。這些不同的作用機制和日益復雜的新型抗體形式的出現，使抗體親和力和功能效力之間關(guān)系的研究成為一項復雜的任務(wù)。

       一、抗體結合親和力與功能性親和力

       結合親和力（affinity）代表了兩個(gè)分子之間結合的緊密程度。它來(lái)源于結合和解離的速率，定義了復雜結構的組裝和分解的速度。在抗體的背景下，靶結合親和力是指CDR與其抗原表位之間的相互作用，它來(lái)自抗體與靶標解離速率常數（Koff）和結合速率常數（Kon）的比值。

       結合親和力也可以來(lái)自其他抗體結構域，如Fc區。由于這些恒定結構域的高度序列同源性，相互作用強度通常是一致的，主要在抗體同種型或Fc受體多態(tài)性之間觀(guān)察到顯著(zhù)差異?？贵w對其抗原的親和力和特異性是由非共價(jià)相互作用驅動(dòng)的，包括氫鍵、范德華力和抗體CDR中氨基酸殘基介導的靜電相互作用。具有相似結合親和力的抗體可能具有不同的動(dòng)力學(xué)。因此，在考慮觀(guān)察到的治療效果時(shí)，了解影響KD值的個(gè)體動(dòng)力學(xué)速率常數是非常重要的。

       由于抗體的二價(jià)形式，抗體同時(shí)與兩種不同的抗原結合，這一概念被稱(chēng)為功能性親和力（avidity）。功能性親和力代表抗體-抗原相互作用的整體強度，受三個(gè)因素的影響--結合親和力（Affinity）、價(jià)數和抗體與抗原的結構排列。功能性親和力來(lái)源于結合位點(diǎn)的共定位，抗體的兩個(gè)CDR結合到同一靶標上，如細胞膜上的抗原。這可以表現為結合親和力的明顯增加，這是由增強的再結合潛力引起的，因為第二個(gè)Fab：抗原相互作用可以在主要復合物解離之前發(fā)生。

       親和力增加可能出于兩個(gè)原因。首先，抗體的兩個(gè)臂都與空間相關(guān)的位點(diǎn)結合，為了完全解離，兩個(gè)臂必須釋放其抗原，導致有效的解離半衰期比單獨的抗體臂長(cháng)得多。其次，當與細胞表面相關(guān)抗原結合時(shí)，抗體在空間上受到限制。一個(gè)潛在的后果是，第二次結合事件是由細胞表面上第二拷貝抗原的局部可用性來(lái)決定的。因此，功能性親和力可以被視為一種協(xié)同作用，其中一個(gè)臂的結合會(huì )導致另一個(gè)臂結合動(dòng)力學(xué)的變化。細胞膜上更高有效抗體濃度的親和力效應將取決于細胞密度和抗原表達水平。

       當目標是最大限度地提高靶參與度，以拮抗靶抗原的生物功能時(shí)，功能性親和力可能是有利的。然而，當目標指向免疫系統時(shí)，如ADCC和ADCP，這種抗體二價(jià)的作用是非常有限的。實(shí)驗觀(guān)察表明，單價(jià)或具有較低內在親和力的工程抗體可能更有效，表現出明顯增加的Emax，這是由于與細胞膜結合的抗體增加。

       二、抗體-抗原相互作用的調節

       近年來(lái)，人們已經(jīng)探索出幾種調節抗體靶點(diǎn)結合的方法。通過(guò)提高抗體親和力或改變價(jià)態(tài)并引入額外的功能域來(lái)實(shí)現抗體與靶點(diǎn)的更強結合。

       抗體序列工程化調節抗體靶親和力

       抗體親和力調節的最早時(shí)間點(diǎn)是在抗體發(fā)現階段。傳統上，抗體親和力的調節可以通過(guò)體外噬菌體、酵母和哺乳動(dòng)物基于展示的抗體發(fā)現模型來(lái)實(shí)現的。親和力調節可以通過(guò)使用這些方法進(jìn)行親和力成熟來(lái)實(shí)現，引入突變以產(chǎn)生具有操縱靶結合親和力的突變庫，此外，可以通過(guò)引入更苛刻的洗滌條件來(lái)選擇高親和力抗體。

       此外，通過(guò)體內技術(shù)可以實(shí)現的高親和力抗體的發(fā)現。通過(guò)調節免疫方案，包括免疫抗原、佐劑、預處理、免疫方案、給藥途徑和靶生物的形式，以最大限度地刺激高親和力抗體的產(chǎn)生，然后通過(guò)B細胞克隆技術(shù)篩選高親和力抗體。進(jìn)一步的創(chuàng )新包括使用表達人源抗體的轉基因動(dòng)物，這些抗體能夠以高親和力結合靶點(diǎn)，并具有更大的臨床轉化前景。

       基于A(yíng)I的親和力優(yōu)化

       二代測序（NGS）通過(guò)基于序列相似性和特征識別可能編碼高親和力抗體的核酸，增強了對高親和力抗體發(fā)現的能力，允許以前所未有的規模篩查編碼核酸的抗體。此外，人工智能和基于機器的學(xué)習（AI/ML）增強了NGS以更高的精度篩選更多高親和力結合序列的能力，并證明了其在抗體、基因聚類(lèi)、從頭設計、優(yōu)化和調節結合親和力方面的能力。

       通過(guò)抗體結構工程化調節靶點(diǎn)結合

       除了靶親和力之外，通過(guò)改造天然單特異性形式之外的結構，可以增強抗體與靶的結合，包括在單個(gè)分子內配對兩組不同的CDR以產(chǎn)生雙特異性抗體。此外，功能結構域的引入導致了更復雜的形式的發(fā)展，如三特異性抗體和免疫細胞因子。

       三、測量抗體-抗原相互作用的方法

       準確測量抗體親和力，理解結合動(dòng)力學(xué)，可以有效指導藥物開(kāi)發(fā)?？贵w-抗原互相作用的測定方法大致可以分成兩大類(lèi)：一類(lèi)是把其中一個(gè)分子（通常是抗原）固定在芯片或者板子上，然后測定另一個(gè)分子（抗體）的結合參數，比如SPR、BLI。另一類(lèi)是直接在活細胞上做實(shí)驗，看抗體怎么結合到細胞表面，比如流式細胞術(shù)、KinExA等等。

       表面等離子共振（SPR）

       SPR被廣泛用于實(shí)時(shí)測量抗體與固定抗原、補體或Fcγ受體的結合動(dòng)力學(xué)。這種高通量、無(wú)標記的技術(shù)提供了對抗體-抗原結合動(dòng)力學(xué)的詳細分析，包括結合率和解離率。通過(guò)固定任一結合伴侶。結合和解離事件會(huì )改變固定分析物的金膜芯片的折射率，從而導致可以實(shí)時(shí)測量的光散射強度的變化。

       然而，在將體外和體內發(fā)現相關(guān)聯(lián)時(shí)，SPR可能缺乏生理相關(guān)性。固定化的細胞表面抗原可能無(wú)法在細胞膜內準確復制其三維結構，溶液中的天然抗原相互作用受到固定化的限制，從而限制了觀(guān)察到的相互作用自由度。此外，SPR中使用的緩沖條件可能無(wú)法準確反映pH、溫度或成分方面的生理結合環(huán)境。

       流式細胞術(shù)

       細胞計量學(xué)細胞結合試驗用于針對固定數量的表達靶抗原的細胞進(jìn)行抗體滴定。這些檢測使用熒光標記的配體或標記的第二抗體來(lái)檢測結合，從而可以確定達到半數結合的濃度（EC50）和最大結合，這可以提供對抗體結合機制的見(jiàn)解。

       設計細胞結合方法時(shí)有幾個(gè)考慮因素，包括配體耗竭和平衡?；诩毎g(shù)的檢測的其他局限性包括抗原：抗體復合物內化，導致觀(guān)察到的抗體結合減少。

       動(dòng)力學(xué)排斥試驗

       動(dòng)力學(xué)排斥試驗（KinExA）是一種基于溶液的試驗，用于確定免疫復合物的結合伴侶濃度和平衡解離常數。在抗體親和力測量中，靶抗原被恒定濃度的抗體結合位點(diǎn)，使其平衡，隨后在流動(dòng)中暴露于抗原包被的珠粒中。用熒光偶聯(lián)的二抗檢測珠捕獲的抗體，從而能夠在平衡時(shí)定量游離抗體并測定抗體親和力。由于這種測定通?？梢赃_到平衡，因此被認為更適合測量高親和力、亞納摩爾的相互作用。

       四、抗體親和力與功能的關(guān)系

       抗體對其靶標的親和力通常被認為與其誘導藥理作用的能力密切相關(guān)。然而，這種相關(guān)性并不完全是線(xiàn)性的，并且高度依賴(lài)于所討論的特定藥理作用，以及它是否是由于靶細胞表面的靶占據或抗體密度引起的。

       緊密結合及其對抗體功能的影響

       高親和力抗體通常會(huì )與其靶抗原表現出"緊密結合"，其特征是當抗體濃度遠低于抗原濃度時(shí)，仍能有效結合，導致游離抗體被耗盡。通?？贵w親和力與其藥理學(xué)效果密切相關(guān)，但親和力與功能的關(guān)系并非總是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，其取決于具體機制和效應來(lái)源。

       拮抗性抗體

       拮抗性抗體通過(guò)直接受體結合或隔離激活配體來(lái)破壞受體信號傳導?？梢酝ㄟ^(guò)觀(guān)察靶受體激活的下游效應來(lái)評估它們的功能，包括從測量信號事件（如配體結合后不久的受體磷酸化）到對細胞增殖或表型的下游影響。通常靶標親和力和效力之間呈線(xiàn)性關(guān)系，更高親和力的抗體能夠在較低濃度下引發(fā)它們的作用。此外，這里可能存在一些表位依賴(lài)性，因為與受體結合結構域結合的抗體比與更遠端表位結合的抗體更有效。

       免疫細胞接合器

       參與抗體的免疫細胞涵蓋了廣泛的作用機制，所有這些機制都會(huì )誘導靶細胞的細胞毒性，例如通過(guò)ADCC、ADCP或CDC。除了這些傳統的Fc介導的效應器功能外，還包括了T細胞和NK細胞結合器，通過(guò)Fab介導的靶向特定效應細胞免疫受體來(lái)招募免疫細胞。

       通常在這些復雜的作用機制中，親和力和功能之間的關(guān)系并沒(méi)有明確界定，其中抗體靶結合與補體或FcγR結合和/或免疫細胞結合是同時(shí)需要的。對于Fc依賴(lài)性細胞毒性機制，高親和力抗體可能導致雙價(jià)結合，占用兩個(gè)抗原但只提供一個(gè)Fc，降低效應細胞募集效率。相比之下，親和力較低的抗體更有可能以單價(jià)結合，導致更大的細胞調理、Fc呈遞，從而導致免疫細胞和補體募集。

       雙特異性T細胞和NK細胞接合器的功能活性受TAA和T/NK細胞靶向域親和力的調節。對TAA的親和力必須足夠高才能與靶標結合，但必須仔細考慮對CD3的親和力，以平衡細胞毒性作用，同時(shí)降低與細胞因子釋放相關(guān)的風(fēng)險。

       激動(dòng)劑抗體

       激動(dòng)劑抗體利用其二價(jià)性質(zhì)促進(jìn)其靶標在靶細胞膜或溶液中的聚集。通過(guò)這種方式，它們可以模仿天然存在的配體，誘導受體激活或靶標交聯(lián)。

       抗體親和力和激動(dòng)活性之間的關(guān)系尚未像拮抗抗體那樣得到廣泛的研究。一項研究調查了靶向三種不同受體（PD-1、CD40和4-1BB）的激動(dòng)性抗體的親和力和功能關(guān)系，這些受體需要聚集才能引發(fā)其激動(dòng)活性。該研究表明親和力和功能之間存在鐘形關(guān)系，低親和力而非高親和力是由更快的解離速率驅動(dòng)的，導致最大的激動(dòng)作用。此外，還觀(guān)察到除親和力之外的抗體的其他特性會(huì )影響體外效力，包括鉸鏈靈活性和對Fab構象的影響。

       抗體偶聯(lián)藥物

       ADC的結構很復雜，其功效受到其物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)特征的影響，如細胞內化、有效載荷釋放和有效載荷的作用機制。連接子-有效載荷與抗體的結合，無(wú)論是通過(guò)共價(jià)還是非共價(jià)修飾，都會(huì )改變ADC的物理化學(xué)特性。

       一般來(lái)說(shuō)，高親和力可能提高細胞內吞和載荷釋放效率，但也可能增加脫靶毒性。而低親和力可能減少脫靶結合，但也可能降低腫瘤細胞攝取效率。親和力的選擇需要平衡靶向性、內吞、載荷釋放和安全性等各方面。

       結語(yǔ)

       抗體結合定量技術(shù)的快速發(fā)展為精準治療和藥物研發(fā)開(kāi)辟了新的可能性。通過(guò)對抗體親和力與功能性親和力的深入理解與優(yōu)化，結合AI技術(shù)、序列工程和功能域設計，我們不僅能夠提升抗體的治療效力和靶向性，還能顯著(zhù)降低副作用風(fēng)險。未來(lái)，隨著(zhù)跨學(xué)科技術(shù)的融合與創(chuàng )新，抗體療法有望在癌癥、自身免疫疾病和感染性疾病等領(lǐng)域實(shí)現更突破性的進(jìn)展，最終為患者提供更安全、更個(gè)性化的治療方案。這一領(lǐng)域的持續探索，將深刻影響生物醫藥的發(fā)展方向與臨床實(shí)踐。

       參考資料：

       1.Quantifying antibody binding: techniques and therapeutic implications. MAbs. 2025 Feb 16;17(1):2459795