為了對使用多種分析技術(shù)建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的控制策略達成共識，我們的建議總結如下。它從介紹性部分開(kāi)始，然后是選擇每個(gè)階段要使用的分析技術(shù)并根據開(kāi)發(fā)階段建立控制策略的指南。如上所述，從討論中摘錄了使用FI的考慮要點(diǎn)。還參考了當前的行業(yè)觀(guān)點(diǎn)、監管指南和藥典，總結了關(guān)于可見(jiàn)顆?？刂频慕ㄗh。

       使用基于風(fēng)險的方法建立控制聚集體和不溶性顆粒的策略，以確保產(chǎn)品的安全性、有效性和免疫原性（圖4）。風(fēng)險評估以開(kāi)發(fā)過(guò)程中獲得的知識為依據，包括聚集體和不溶性顆粒的綜合表征。建議使用各種分析技術(shù)來(lái)全面表征蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒。正交技術(shù)有助于評估顆粒性質(zhì)（外源、內征或內在）、顆粒數量、顆粒粒度分布以及區分顆粒的其他特性。了解蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的特性可用于確定潛在的形成機制。這些知識還可用于指導配方或制造工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中的配方和工藝參數的選擇，從而減少最終藥品中的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒。

       圖4 通過(guò)基于風(fēng)險的方法建立聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘挠媱?/p>

       3.1 開(kāi)發(fā)階段（第1-3期）

       SEC、LO和目視檢查等常用分析技術(shù)用于臨床試驗中使用的原料藥和產(chǎn)品的放行或穩定性測試。如果需要，FI可用于產(chǎn)品的脫?；蚍€定性。對于原料藥的額外監測和表征，可以使用使用MALS作為SEC檢測器的SEC-MALS、AUC和DLS。FI可用于藥品的額外監測和表征。LO和FI用于監測和分析>10μm和<10μm顆粒的特性。

       應考慮使用其他技術(shù)來(lái)解決隨著(zhù)開(kāi)發(fā)進(jìn)程而出現的問(wèn)題。例如，qLD、NTA、RMM、ESZ、靜態(tài)光散射（SLS）、LM、BMI、FT-IR和拉曼光譜等技術(shù)可能有助于了解聚集體和不溶性顆粒，包括亞可見(jiàn)和可見(jiàn)顆粒的數量和分布、它們的來(lái)源以及與制造過(guò)程的相關(guān)性。更先進(jìn)的分析技術(shù)，如全息視頻顯微鏡或機器學(xué)習工具，可以用作SEC、LO和FI的正交技術(shù)。使用多種技術(shù)，可以闡明聚集體和顆粒形成背后的因素和機制，例如在填充過(guò)程中從泵產(chǎn)生的金屬顆粒充當聚集體形成的核，以及用作表面活性劑的泊洛沙姆的材料屬性（疏水性）參與可見(jiàn)顆粒的形成。因此，通過(guò)結合多種技術(shù)獲得的信息最終將有助于建立風(fēng)險緩解措施，以減少制造過(guò)程中顆粒的產(chǎn)生。當難以評估發(fā)育過(guò)程中檢測到的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的安全風(fēng)險時(shí)，除了顆粒組成、尺寸分布和數量的分析結果外，生物活性（例如體外免疫細胞活化）的評估可能為建立控制策略提供有用的信息。

       3.2 配方開(kāi)發(fā)和使用中/相容性研究

       為了靈敏地檢測配方的差異和應力引起的變化，與其他步驟相比，評估<10μm顆粒更為重要。特別是，在檢查配方時(shí)，選擇能夠以高通量分析少量樣品的技術(shù)或儀器。除了SEC、LO和FI之外，DLS是另一種用于配方開(kāi)發(fā)的技術(shù)。qLD、NTA、RMM、SLS和BMI也可用于評估亞微米到亞可見(jiàn)的顆粒。雖然不包括在問(wèn)卷中，但濁度和粘度被用作配方開(kāi)發(fā)的指標。

       3.3 商業(yè)生產(chǎn)

       放行和穩定性測試需要成熟、授權且符合法規的技術(shù)或程序。作為這些測試的一部分，使用SEC測試原料藥的純度。對于藥品，除了SEC之外，還通過(guò)LO進(jìn)行目視檢查和不可見(jiàn)顆粒測試?？刂撇呗赃€包括對開(kāi)發(fā)過(guò)程中確定的相關(guān)原材料（添加劑，如表面活性劑和容器密封系統）和制造工藝參數（原料藥的病毒滅活和純化過(guò)程以及藥品的灌裝過(guò)程）的控制。此外，在監測原料藥或藥品的聚集體和不溶性顆粒時(shí)，應建立行動(dòng)限值，以表明是否需要進(jìn)一步研究。對于可能在開(kāi)發(fā)過(guò)程中或商業(yè)生產(chǎn)開(kāi)始后進(jìn)行的可比性研究，如上所述，SEC、LO和目視檢查將是基礎，也使用FI和DLS。

       3.4 根本原因分析

       如果在目視檢查過(guò)程中檢測到可見(jiàn)顆粒，則應進(jìn)行根本原因分析。為了進(jìn)行根本原因分析，應確定顆粒中的元素，并立即確定顆粒來(lái)源。常用的技術(shù)包括FT-IR、拉曼顯微鏡、EM和電子顯微鏡能量色散X射線(xiàn)（EM-EDX）。

       3.5 利用FI建立控制策略

       FI提供有關(guān)亞可見(jiàn)顆粒的數量（濃度）及其形態(tài)參數的信息。因此，它用于定量和定性評估不可見(jiàn)顆粒?？紤]到這些特性，FI可用于早期開(kāi)發(fā)期間或1-3階段的配方開(kāi)發(fā)、穩定性測試和監測。當檢測到顆粒數量突然增加等趨勢時(shí)，FI也可用于確定原因或故障排除，例如，通過(guò)從形態(tài)參數推斷顆粒增加的來(lái)源（蛋白質(zhì)顆粒、硅油或空氣）。此外，所得顆粒圖像可用于結合機器學(xué)習來(lái)估計導致蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的制造過(guò)程或應力類(lèi)型。

       一般藥典測試方法（USP788、787、Ph.Eur.2.9.19、JP6.07、6.17）中未包含FI，并且存在輕微的穩定性問(wèn)題。因此，它們通常不用作商業(yè)生產(chǎn)中的放行或穩定性測試。確定開(kāi)發(fā)過(guò)程中特性測試的結果（包括FI）與放行測試結果（如LO）之間的相關(guān)性，可能有助于制定合理的控制策略。例如，如果在開(kāi)發(fā)階段同時(shí)使用LO和FI的批次分析結果是相關(guān)的，則在商業(yè)生產(chǎn)中可能僅使用LO來(lái)捕獲趨勢。但是，如果FI可以檢測到LO無(wú)法捕獲的波動(dòng)，那么在商業(yè)生產(chǎn)中應用FI進(jìn)行監測可能是一種有效的降低風(fēng)險措施。

       3.6 可見(jiàn)粒子控制的注意事項

       由于可見(jiàn)顆粒的無(wú)意污染可能會(huì )被召回，因此有必要制定控制策略以最大限度地減少可見(jiàn)顆粒的發(fā)生和影響。除了根據GMP進(jìn)行環(huán)境控制外，產(chǎn)品和制造工藝的適當設計也很重要。在整個(gè)制造過(guò)程中控制可見(jiàn)顆粒包括建立包裝材料的驗收標準、制備藥物溶液、灌裝作、對灌裝產(chǎn)品進(jìn)行100%檢查以及最終決定運輸。此外，應考慮目視檢查的生命周期，包括檢查資格、檢查員培訓、缺陷表征以及通過(guò)趨勢分析進(jìn)行持續改進(jìn)。

       目視檢查從填充后的100%檢查開(kāi)始。應設置代表性拒絕率限值，以識別不符合標準的批次?？梢詾槊總€(gè)缺陷類(lèi)別（關(guān)鍵、主要和次要）和可見(jiàn)粒子源設置限值。經(jīng)過(guò)100%檢查后，應從檢驗員判斷適合目視檢查的容器中選擇統計上合理的樣品數量。樣本量和缺陷容器的數量可以根據AQL確定。通常，分別為高風(fēng)險和低風(fēng)險缺陷設置低（嚴格）和高（寬松）AQL。一旦超過(guò)檢驗限值或AQL允許的缺陷數量，應啟動(dòng)調查。調查可能包括重新測試、識別和表征檢測到的可見(jiàn)顆粒，以及根本原因分析。

       可以根據患者影響的風(fēng)險和法規遵從性對缺陷進(jìn)行分類(lèi)。嚴重缺陷可能導致患者發(fā)生嚴重不良事件或死亡，例如與無(wú)菌產(chǎn)品的容器完整性不相容導致微生物污染的風(fēng)險。重大缺陷存在暫時(shí)性產(chǎn)品故障或醫學(xué)上可逆反應的風(fēng)險，但引起嚴重副作用的可能性很小。輕微缺陷不會(huì )影響產(chǎn)品性能或合規性，而只影響產(chǎn)品的外觀(guān)。

       根據它們的來(lái)源，可見(jiàn)粒子可以分為外源、內在或內在。外源性顆粒源于正常的制造過(guò)程之外。在為外源性顆粒設定限值時(shí)，應考慮外源性顆粒含量高的批次可能造成較高的微生物污染風(fēng)險，并表明缺乏GMP控制。由于本征顆粒來(lái)自制造過(guò)程中使用的原材料、設備和內包裝，因此應在早期開(kāi)發(fā)階段確定其原因，并采取措施防止產(chǎn)品有缺陷。由于本征顆粒包括蛋白質(zhì)顆粒和來(lái)自最終藥品的其他顆粒，因此在開(kāi)發(fā)過(guò)程中應評估批次內的顆粒分布。

       在檢查過(guò)程中，可靠地去除了帶有外源性和內源性顆粒的容器，原則上也應去除內在顆粒。但是，如果滿(mǎn)足商品外觀(guān)規格，該測試可能會(huì )允許接受固有顆粒。此外，內源性顆粒（如硅油液滴和蛋白質(zhì)顆粒）可能允許出現在可檢測到的產(chǎn)品中。是否應允許可見(jiàn)顆粒必須根據其識別和表征、導致其發(fā)生的因素的調查以及安全風(fēng)險評估來(lái)確定。如果測試允許可見(jiàn)顆粒，則必須制定控制策略，包括釋放測試，以控制可見(jiàn)顆粒?？梢钥煽繙y定的顆粒大小取決于配方、容器和顆粒特性。建議準備適當的標準品和限量樣品，并使用它們來(lái)培訓檢查員區分可接受和有缺陷的單位容器。此外，在穩定性測試期間，應監測任何可能隨時(shí)間產(chǎn)生大于可接受標準的顆?；驍盗看笥隍炇諛藴实念w粒的變化。

       【NO.4】結論

       根據調查結果，本文討論了評估和控制聚集體和不溶性顆粒的方法。SEC、LO和目視檢查從早期開(kāi)發(fā)和配方考慮到商業(yè)生產(chǎn)都得到一致使用。除了這些分析方法外，FI是亞可見(jiàn)顆粒表征最常用的技術(shù)。然而，由于在日本批準的大多數生物制藥都是許可產(chǎn)品，很少有產(chǎn)品是獨立開(kāi)發(fā)的，因此關(guān)于如何利用FI存在各種想法。因此，本研究建立了目前對使用FI建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘睦斫?。隨著(zhù)技術(shù)的進(jìn)步，需要進(jìn)一步的研究和討論來(lái)構建新的方法。在商業(yè)制造中，當在目視檢查過(guò)程中檢測到顆粒時(shí)，需要進(jìn)行根本原因分析。然而，許多公司將檢測到的顆粒物的鑒定外包出去，需要注意的技術(shù)要點(diǎn)可能不會(huì )在相關(guān)方之間共享。盡管蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的表征有助于質(zhì)量控制策略的開(kāi)發(fā)，但無(wú)法定量評估亞微米顆粒（從大約100nm到1μm）被認為是分析技術(shù)面臨的挑戰。更先進(jìn)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應用可能會(huì )解決這些挑戰。此外，應確保新分析技術(shù)的有效性以促進(jìn)其使用。除了開(kāi)發(fā)新技術(shù)和改進(jìn)設備外，還需要開(kāi)展促進(jìn)測量協(xié)議標準化的合作活動(dòng)，包括應用新的參考物質(zhì)，這將是有效的。

       除了調查結果外，關(guān)于建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘慕ㄗh也總結在要考慮的要點(diǎn)部分中。全球尚無(wú)全面解決蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒問(wèn)題的監管指南。我們希望我們的建議將有助于促進(jìn)其他生物制藥的發(fā)展并確保其質(zhì)量和安全。