摘要：高濃度蛋白質(zhì)溶液在生物制藥中應用廣泛，其制備方法通常在早期研發(fā)階段采用旋轉柱濃縮（SCC），后期采用切向流過(guò)濾（TFF） 。本研究以一種 Fc 融合蛋白為例，發(fā)現兩種方法制備的高濃度溶液在儲存穩定性上存在差異 。TFF 處理的樣品在儲存時(shí)聚集和粘度增加更明顯，這是由于 TFF 過(guò)程中在中間不穩定緩沖條件下的剪切作用，導致蛋白質(zhì)構象改變 。因此，早期研發(fā)階段測試 TFF 過(guò)程中過(guò)渡緩沖狀態(tài)下的剪切應力敏感性，對降低產(chǎn)品不穩定風(fēng)險十分重要 。
一、高濃度蛋白質(zhì)溶液的制備與穩定性問(wèn)題
在生物制藥領(lǐng)域，為滿(mǎn)足患者需求并降低成本，高濃度蛋白質(zhì)制劑備受青睞，尤其是用于皮下注射的高劑量蛋白質(zhì)治療藥物 。不過(guò)，開(kāi)發(fā)這類(lèi)制劑面臨諸多挑戰，其中溶液粘度增加和蛋白質(zhì)聚集傾向是較為突出的問(wèn)題 。在藥物研發(fā)過(guò)程中，早期由于蛋白質(zhì)樣品量有限，常采用 SCC 方法進(jìn)行緩沖液交換和濃縮；后期隨著(zhù)蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加，則會(huì )使用 TFF 方法 。通常認為這兩種方法制備的蛋白質(zhì)性質(zhì)相似，但本研究發(fā)現，對于一種 Fc 融合蛋白，SCC 和 TFF 制備的高濃度溶液在儲存穩定性上存在顯著(zhù)差異 。這種差異表明，緩沖液交換路徑可能對蛋白質(zhì)的儲存穩定性和粘度產(chǎn)生重要影響 。
二、實(shí)驗方法
蛋白質(zhì)的制備與處理：首先通過(guò)模型細胞系生產(chǎn) Fc 融合蛋白，經(jīng) Protein A 捕獲和離子交換色譜法純化后得到未配方的 bulk drug substance（UFBDS） 。對部分 UFBDS 添加聚山梨酯 80（PS80）得到配方的 bulk drug substance（FBDS） 。然后分別用 SCC 和 TFF 兩種方法將蛋白質(zhì)溶液濃縮至目標濃度 。SCC 是利用離心過(guò)濾裝置將 UFBDS 濃縮，TFF 則是使用特定的膜系統在一定壓力和通量條件下進(jìn)行緩沖液交換和濃縮（可簡(jiǎn)單繪制 SCC 和 TFF 過(guò)程的示意圖，幫助讀者理解兩種方法的操作流程） 。
分析方法：運用多種分析技術(shù)對樣品進(jìn)行檢測 。采用尺寸排阻色譜（SEC）監測蛋白質(zhì)聚集情況，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量流體力學(xué)半徑，用非還原毛細管電泳 - 十二烷基硫酸鈉（CE - SDS）分析大小變體，使用 Malvern Viscosizer™ 200 測定粘度，利用差示掃描量熱法（DSC）和差示掃描熒光法（DSF）研究蛋白質(zhì)的熱穩定性和構象變化 。此外，還通過(guò)組合篩選實(shí)驗，研究不同緩沖條件和剪切應力對蛋白質(zhì)聚集的影響 。
三、實(shí)驗結果
儲存穩定性差異：在不同溫度（5°C、25°C 和 40°C）下儲存 3 個(gè)月后，TFF 處理的樣品在聚集、流體力學(xué)半徑、大小變體和粘度等方面均表現出比 SCC 處理樣品更明顯的變化 。例如，在 25°C 和 40°C 儲存時(shí)，TFF 樣品的聚集程度（以 % HMWS 表示）更高（原文 Fig. 1，直觀(guān)展示 TFF 和 SCC 樣品在加速儲存條件下的聚集情況差異）；40°C 儲存 3 個(gè)月后，TFF 樣品的流體力學(xué)半徑更大（原文 Fig. 2，呈現不同處理樣品在不同儲存溫度下的流體力學(xué)半徑變化）；在 CE - SDS 分析中，40°C 儲存時(shí) TFF 樣品的降解片段濃度更高（原文 Fig. 3，展示 TFF 和 SCC 樣品在 40°C 儲存 3 個(gè)月后的大小變體差異）；而且 TFF 樣品的粘度在儲存后顯著(zhù)增加，而 SCC 樣品的粘度幾乎不變（原文 Fig. 4，對比 TFF 和 SCC 樣品在不同儲存溫度下的粘度變化） 。
材料特性差異：盡管兩種方法制備的蛋白質(zhì)溶液在生產(chǎn)后立即進(jìn)行的常規釋放檢測中表現相似，但 DSF 分析顯示，TFF 處理的蛋白質(zhì)在較低溫度下就開(kāi)始與熒光染料發(fā)生相互作用，表明其三級結構發(fā)生了變化，疏水性表面暴露更多，相比 SCC 處理的蛋白質(zhì)更不穩定 。而 DSC 數據未顯示出兩者的差異（原文 Fig. 5 和 Fig. 6，對比 DSC 和 DSF 對 TFF 和 SCC 處理材料的分析結果） 。
緩沖條件和剪切應力的影響：實(shí)驗發(fā)現，在從一種緩沖液轉換到另一種緩沖液的過(guò)程中，特別是在 0.5 - 1.5 倍透析體積的中間緩沖條件下，蛋白質(zhì)穩定性較差。當樣品處于這種中間緩沖條件并受到剪切應力時(shí)，蛋白質(zhì)損失和聚集現象更為嚴重（原文 Fig. 7，展示不同緩沖條件和剪切應力組合下蛋白質(zhì)的損失情況）。進(jìn)一步研究發(fā)現，對較低濃度的蛋白質(zhì)樣品施加不同程度的剪切應力，并在 35°C 儲存后，樣品的聚集程度與剪切暴露相關(guān)，且蛋白質(zhì)構象也發(fā)生了變化，這通過(guò) FTIR 光譜分析得到了證實(shí)（原文 Fig. 8，呈現剪切應力和儲存溫度對蛋白質(zhì)聚集和構象的影響）。
四、結果討論
兩種制備方法的差異：在藥物研發(fā)早期，SCC 常被用作 TFF 的替代方法，但本研究表明二者存在差異 。TFF 處理的蛋白質(zhì)在儲存時(shí)更易聚集，粘度也更高，這可能是因為 TFF 過(guò)程中蛋白質(zhì)在中間不穩定緩沖條件下受到剪切，導致構象發(fā)生變化 。雖然 DSC 顯示兩種方法處理的蛋白質(zhì)解折疊溫度相似，但 DSF 結果表明 TFF 處理的蛋白質(zhì)在較低溫度下就會(huì )暴露更多疏水區域，說(shuō)明其構象穩定性較差 。
緩沖條件和剪切應力的作用：蛋白質(zhì)的構象由非共價(jià)力維持，在 TFF 過(guò)程中，隨著(zhù)蛋白質(zhì)濃度增加，溶液粘度和維持通量所需的壓力也會(huì )增加，再加上透析過(guò)程中復雜的緩沖環(huán)境，容易破壞蛋白質(zhì)的構象穩定性 。從純化緩沖液到配方緩沖液的交換過(guò)程中，中間緩沖狀態(tài)可能使蛋白質(zhì)形成部分解折疊的中間體，若這些中間體保留在最終產(chǎn)品中，會(huì )影響蛋白質(zhì)的穩定性 。此外，剪切應力本身雖不一定會(huì )導致蛋白質(zhì)顯著(zhù)聚集或降解，但在不穩定的緩沖環(huán)境下，會(huì )加劇蛋白質(zhì)的聚集 。
對藥物研發(fā)的啟示：了解蛋白質(zhì)對緩沖條件和剪切應力的敏感性，對開(kāi)發(fā)穩定的藥物制劑至關(guān)重要 。早期研究中使用 SCC 方法可能無(wú)法發(fā)現蛋白質(zhì)對特定緩沖環(huán)境的不穩定性，而在后期 TFF 過(guò)程中這種問(wèn)題可能會(huì )顯現出來(lái) 。因此，在早期研發(fā)階段就應測試蛋白質(zhì)在 TFF 過(guò)程中過(guò)渡緩沖狀態(tài)下的剪切應力敏感性，以避免在藥物開(kāi)發(fā)后期出現意外問(wèn)題 。
五、研究結論
本研究通過(guò)對 Fc 融合蛋白的研究發(fā)現，TFF 和 SCC 制備的高濃度蛋白質(zhì)溶液在儲存穩定性上存在差異，TFF 過(guò)程中在中間不穩定緩沖條件下的剪切作用會(huì )導致蛋白質(zhì)構象改變，進(jìn)而使 TFF 處理的材料在儲存時(shí)聚集速率和粘度更高 。對于對緩沖條件敏感的蛋白質(zhì)，早期研究其在剪切應力下對緩沖液交換環(huán)境的敏感性，有助于開(kāi)發(fā)更穩健的配方和工藝，避免藥物開(kāi)發(fā)后期出現產(chǎn)品穩定性問(wèn)題 。
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