基因編輯技術(shù)的興起，尤其是 Cas9 敲入小鼠的開(kāi)發(fā)，顯著(zhù)加速了遺傳學(xué)、基因組學(xué)、免疫學(xué)和癌癥等多個(gè)領(lǐng)域的功能發(fā)現。然而，人類(lèi)疾病的基因多效性和基因相互作用網(wǎng)絡(luò )的復雜性需要一種能夠同時(shí)進(jìn)行多重基因編輯的敲入小鼠模型。
2025年3月20日，耶魯大學(xué)陳斯迪課題組在Nature Biomedical Engineering 期刊發(fā)表了題為：Cas12a knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune cell engineering的研究論文。
該研究開(kāi)發(fā)出多種 Cas12a 敲入小鼠模型，助力針對復雜基因互作網(wǎng)絡(luò )，疾病建模與免疫遺傳學(xué)的研究。
在這項最新研究中，陳斯迪教授團隊開(kāi)發(fā)了一系列背景為 C57BL/6 的 Cre 依賴(lài)的條件性表達小鼠或組成性表達 Cas12a 小鼠模型，包括 LbCas12a 和高保真增強版 AsCas12a（enAsCas12a-HF1）。
研究團隊首先通過(guò)與 CMV-Cre 小鼠交配獲得了組成性表達 Cas12a 蛋白的小鼠，驗證了 Cas12a 蛋白的表達及在不同主要器官中的表達量，并通過(guò)全鼠表型分析證實(shí) Cas12a 的組成性表達并未導致與 C57BL/6 背景品系相比的任何可辨別的病理差異。通過(guò)使用 LbCas12a 和 enAsCas12a 小鼠原代免疫細胞，他們在 T 細胞和骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細胞（BMDC）中實(shí)現了高效的雙基因編輯（Double Knockout）。高通量測序結果顯示，使用 enAsCas12a 小鼠系統可以在這些細胞類(lèi)型中實(shí)現高達 90% 的基因編輯效率。
為了驗證 Cas12a 敲入小鼠在體內基因編輯中的應用，研究團隊使用 LNP 系統將靶向 Ttr 基因的CRISPR RNA（crRNA）遞送到組成性表達 enAsCas12a 的小鼠體內。實(shí)驗結果顯示，注射后 6 天，血清中 TTR 蛋白水平顯著(zhù)下降，并在 20 天內保持穩定。這表明，LNP-crRNA 系統在體內具有高效的基因靶向能力。
為了進(jìn)一步驗證 Cas12a 敲入小鼠優(yōu)越的的體內基因編輯效率及在癌癥建模中的應用，研究團隊設計了一個(gè)包含四個(gè)腫瘤抑制基因（Trp53、Pten、Apc和Rb1）的 AAV-crTSG 表達陣列，并通過(guò) AAV 系統遞送到條件性表達 enAsCas12a 小鼠體內。結果顯示，注射后一個(gè)月內，所有注射 AAV-crTSG 的小鼠均在頭頸部位形成了侵襲性腫瘤，而對照組小鼠（注射AAV-vector）未觀(guān)察到腫瘤形成。組織學(xué)分析顯示，這些腫瘤具有典型的鱗狀細胞癌特征，并且腫瘤細胞中表達 enAsCas12a-HF1-GFP 蛋白，表明腫瘤的形成是由 AAV-crTSG 介導的基因編輯引起的。
為了實(shí)現同步基因激活和敲除，研究團隊將 LSL-enAsCas12a-HF1 小鼠與 dCas9-SPH 轉基因小鼠交配，生成了 LSL-enAsCas12a-HF1；dCas9-SPH 雙轉基因小鼠。雙轉基因老鼠及配合設計的一個(gè)包含 Cas9-sgRNA 和 Cas12a-crRNA 的融合引導 RNA 系統，研究團隊建立了一個(gè)同時(shí)進(jìn)行雙基因激活和敲除（DAKO）的系統。DAKO 系統的有效性在 BMDC 細胞實(shí)驗中得到驗證，流式分析實(shí)驗結果顯示，DAKO 系統在單個(gè)細胞水平上同時(shí)實(shí)現雙基因激活和敲除，為研究復雜基因相互作用網(wǎng)絡(luò )提供了強大的工具。
Cas12a 敲入小鼠的開(kāi)發(fā)為多重基因編輯、疾病建模和免疫遺傳學(xué)研究提供了一個(gè)強大的平臺。這些小鼠品系及其伴隨的病毒和非病毒遞送載體，共同構成了一個(gè)廣泛適用的工具包，能夠應用于基因編輯、免疫細胞工程、免疫學(xué)發(fā)現和復雜基因相互作用的解卷積。隨著(zhù)遞送載體的優(yōu)化及靶點(diǎn)組合的精確設計，Cas12a 敲入小鼠有望在臨床治療中發(fā)揮重要作用，不僅應用于腫瘤治療，還可擴展至其他疾病領(lǐng)域，為精準個(gè)性化治療和通用治療鋪平道路。
該研究由耶魯大學(xué)陳斯迪教授課題組主導完成，耶魯大學(xué)博士學(xué)生唐開(kāi)元和周立群為該論文的共同第一作者。陳斯迪教授、約翰·霍普金斯醫學(xué)院Matthew Dong，以及即將成為威斯塔研究所（The Wistar Institute）獨立PI的周小宇博士為該論文的共同通訊作者。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41551-025-01371-2
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