要了解單細胞中單個(gè) RNA 分子的多種動(dòng)態(tài)行為，就需要實(shí)時(shí)以高分辨率對其進(jìn)行可視化。然而，目前還沒(méi)有能夠以通用的方式實(shí)現對未經(jīng)修飾的內源性 RNA 進(jìn)行單分子活細胞成像。
2025年2月18日，諾貝爾化學(xué)獎得主、CRISPR 基因編輯技術(shù)先驅 Jennifer Doudna 教授團隊在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm 的研究論文。
該研究開(kāi)發(fā)了一種基于 CRISPR–Csm 系統的單分子活細胞熒光原位雜交（smLiveFISH）技術(shù)，能夠直接且高效地在可視化各種細胞類(lèi)型中的任何未經(jīng)修飾的單個(gè) RNA 分子。利用 smLiveFISH 技術(shù)，研究團隊在活細胞中追蹤單個(gè)天然 NOTCH2 和 MAP1B 的 mRNA 轉錄本，并確定了其 mRNA 的不同的定位機制。
RNA 直接參與蛋白質(zhì)合成，并在轉錄和轉錄后水平調控基因表達。除了 RNA 序列之外，個(gè)體轉錄本的時(shí)空分布也控制著(zhù)這些活動(dòng)。事實(shí)上，RNA、RNA結合蛋白（RBP）和其他細胞機制之間的動(dòng)態(tài)和協(xié)調的相互作用發(fā)生在特定的亞細胞區域和時(shí)間點(diǎn)。
活細胞 RNA 成像方法已開(kāi)始揭示單個(gè)細胞內的 RNA 動(dòng)態(tài)，彰顯了此類(lèi)研究的重要價(jià)值。然而，基于莖環(huán)結構（Stem Loop）或適體（Aptamer）的標記方法需要在 RNA 特定區域插入基因序列，或依賴(lài)外源表達標記 RNA——這些操作既耗時(shí)又可能干擾 RNA 的天然行為。使用分子信標或 CRISPR-Cas 系統實(shí)現未修飾內源 RNA 可視化的方法，則受限于單分子分辨率不足（通常僅限于高豐度重復 RNA ）以及內體滯留探針或過(guò)表達熒光蛋白融合體產(chǎn)生的嚴重背景噪聲。
盡管現有方法在特定案例中已獲成功，但開(kāi)發(fā)通用型單分子水平活細胞原生 RNA 成像平臺的需求日益迫切。
在這項最新研究中，研究團隊開(kāi)發(fā)了一種單分子活細胞熒光原位雜交（single-molecule live-cell fluorescence in situ hybridization，smLiveFISH）技術(shù)，該技術(shù)利用來(lái)自嗜熱鏈球菌的 RNA 靶向的 III-A 型 CRISPR-Csm 系統以及多重向導 RNA，能夠直接且高效地在包括原代細胞在內的多種細胞類(lèi)型中對任何未經(jīng)修飾的單個(gè) RNA 分子進(jìn)行可視化成像，從而追蹤不同種類(lèi)活細胞中的單個(gè) mRNA 分子。
smLiveFISH成像天然單個(gè) mRNA 分子的原理
研究團隊利用 smLiveFISH 技術(shù)分析了兩種不同 mRNA（NOTCH2 和 MAP1B）的行為，這兩種 mRNA 分別編碼一種細胞表面受體蛋白和一種微管相關(guān)蛋白。結果顯示，NOTCH2 的 mRNA 包含兩種具有不同動(dòng)態(tài)特性的群體，這與共翻譯多肽在內質(zhì)網(wǎng)（ER）中的跨膜轉運有關(guān)。相比之下，MAP1B 的 mRNA 表現出幾種不同的行為，包括以不依賴(lài)翻譯的方式進(jìn)行定向運輸。
活細胞中單個(gè) NOTCH2 mRNA 的動(dòng)態(tài)變化
活細胞中單個(gè) MAP1B mRNA 的動(dòng)態(tài)變化
研究團隊進(jìn)一步證明，smLiveFISH 能夠檢測出單個(gè)轉錄本在對小分子作出反應時(shí)定位上的差異，例如被整合入 mRNA 處理小體（也叫做 P 小體），這突顯了 smLiveFISH 技術(shù)在評估單個(gè)內源性 RNA 行為中的實(shí)用性。因此，smLiveFISH 技術(shù)有可能揭示健康和疾病狀態(tài)下天然轉錄本的時(shí)空組織原理。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02540-5
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