Protein A 親和層析是一種高效且特異性強的純化技術(shù)，廣泛應用于單克隆抗體(mAb)及具有Fc結構域的分子如融合蛋白和雙特異性抗體的捕獲。然而，傳統的Protein A 親和層析在洗脫過(guò)程中需要使用低pH(3.0-4.0)，這不僅可能導致對低pH敏感的分子產(chǎn)物降解，例如碎片化、聚集等，而且對產(chǎn)品的穩定性和質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。

為了解決這一問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了新型的Protein A 填料，其配基設計經(jīng)過(guò)優(yōu)化，能夠在較溫和的pH條件下實(shí)現洗脫。例如，Purolite公司推出的Praesto Jetted A50 HipH填料，通過(guò)對其Fc和VH3結合區的序列進(jìn)行修改，使其能夠在pH 4.6或更高的條件下洗脫Fc融合蛋白和大多數mAb。優(yōu)化后的洗脫和洗滌條件不僅實(shí)現了高回收率(>90%單體收率)，還顯著(zhù)減少了高分子量(HMW)物質(zhì)(>50%)，并在盡可能溫和的洗脫pH下有效清除了宿主細胞蛋白(HCP)。

對于pH穩定的mAb和pH敏感的融合蛋白，在優(yōu)化條件下進(jìn)行細胞培養物料的純化，結果表明，溫和洗脫pH填料能夠以可接受的收率純化產(chǎn)物，雜質(zhì)清除率相當或更好，且與傳統填料相比，天然洗脫液pH明顯更溫和。特別是在pH敏感蛋白的純化中，優(yōu)勢更加明顯，使用溫和洗脫緩沖液和天然洗脫pH，洗脫液中HMW含量在48小時(shí)內僅有2%保持穩定。而傳統需要低pH洗脫的Protein A填料，洗脫液HMW水平則為8%，在相同保持時(shí)間內增加到16%。

此外，這些新型填料還具有高動(dòng)態(tài)結合載量，并允許使用傳統的HCP洗滌方法。因此，Praesto Jetted A50 HipH填料成為平臺Protein A填料的理想候選者，為pH敏感蛋白和穩定的mAb提供了更大的靈活性，同時(shí)確保了產(chǎn)物質(zhì)量、收率以及與下游工藝的無(wú)縫集成。

亮點(diǎn)

?ProA 配基的 Fc 和VH3 結合區的修改可以允許溫和的洗脫 pH。

?Jetted A50 HipH 可以在 pH 4.6 或以上時(shí)洗脫含 Fc 的蛋白質(zhì)。

?可以實(shí)現溫和的洗脫 pH 值并實(shí)現高收率以及 >50% 的 HMW 減少率。

?pH敏感蛋白質(zhì)可以在穩定的pH區域內洗脫，并且隨時(shí)間保持穩定。

? Jetted A50 HipH 是一種適用于穩定和不穩定蛋白質(zhì)的靈活平臺 ProA 填料。

簡(jiǎn)介

自20世紀80年代以來(lái)，抗體及其相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)經(jīng)歷了顯著(zhù)的增長(cháng)，逐漸成為生物制藥領(lǐng)域中的主導產(chǎn)品類(lèi)別。這一增長(cháng)趨勢不僅推動(dòng)了對這些產(chǎn)品需求的不斷攀升，也促使上游和下游工藝技術(shù)迅速發(fā)展，以滿(mǎn)足日益增長(cháng)的市場(chǎng)需求。

在單克隆抗體(mAb)或Fc融合蛋白的純化過(guò)程中，Protein A親和層析作為一種關(guān)鍵的初步捕獲步驟，被廣泛應用于從細胞培養收獲物中分離目標產(chǎn)物。該技術(shù)利用來(lái)自金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的天然或重組Protein A配基，將其與基質(zhì)偶聯(lián)，以實(shí)現對目標分子的特異性結合。

天然Protein A由五個(gè)同源結構域(E、D、A、B和C)組成，這些結構域均能與免疫球蛋白G(IgG)的Fc區發(fā)生相互作用，尤其對IgG1、IgG2和IgG4亞型表現出較強的親和力。由于Protein A填料具有高選擇性和結合親和力，它們在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中被廣泛應用于含Fc分子的平臺方法中，成為不可或缺的一部分。

為了進(jìn)一步提升Protein A填料的性能，多年來(lái)研究人員通過(guò)工程改造Protein A配基或填料基質(zhì)，做出了諸多努力和改進(jìn)。這些改造主要集中在提高填料的結合載量和堿穩定性方面，以滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)中對高效率和高純度蛋白質(zhì)純化的需求。通過(guò)這些不斷的技術(shù)創(chuàng )新和優(yōu)化，Protein A親和層析技術(shù)得以在生物制藥領(lǐng)域持續發(fā)揮其重要作用，為抗體和抗體相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了有力支持。

在生物制藥領(lǐng)域，Protein A填料是單克隆抗體(mAb)純化過(guò)程中不可或缺的工具，其通過(guò)與抗體的Fc區域特異性結合，實(shí)現高效的捕獲和純化。然而，對于Fc融合蛋白等對低pH敏感的蛋白質(zhì)，傳統的Protein A填料在低pH洗脫條件下可能會(huì )導致蛋白質(zhì)聚集，增加免疫原性風(fēng)險，影響藥物的安全性和有效性。因此，開(kāi)發(fā)新型的Protein A填料或優(yōu)化純化工藝，以降低低pH敏感蛋白質(zhì)的聚集風(fēng)險，對于提高Fc融合蛋白等藥物的生產(chǎn)質(zhì)量和效率具有重要意義。

研究表明，在洗脫緩沖液中添加穩定劑或采用提高洗脫pH值的策略，例如使用高濃度的氯化鈉、氯化鎂或精氨酸溶液，可有效抑制聚體的形成。然而，為了與后續的精純步驟更好地銜接，通常需要額外的步驟來(lái)去除這些添加物，以達到預期的效果。

針對對低pH敏感的分子，一種Protein A層析的策略是直接中和洗脫液，以減少其在低pH條件下的暴露時(shí)間，從而大程度地降低聚體的形成。這需要在收集容器中預先準備好適量的中和緩沖液，以便洗脫液一加入即被中和。中和緩沖液與洗脫液的準確體積和比例至關(guān)重要，以確保洗脫液的pH值迅速進(jìn)入分子穩定的范圍。這種策略可以有效減少蛋白質(zhì)聚集，使得傳統的Protein A層析可用于純化低pH敏感分子。然而，該方法需要精確控制，以確保在大規模生產(chǎn)中能夠快速且充分地混合，這增加了工藝的復雜度。此外，該工藝的穩定性和靈活性較差，因為必須根據預定的洗脫體積提前制備中和緩沖液體積。對于那些在低pH洗脫過(guò)程中容易在柱上快速聚集的分子，該策略的應用也受到限制。

為了應對純化pH敏感抗體和Fc融合蛋白所面臨的挑戰，Repligen與Navigo Proteins合作，開(kāi)發(fā)出了一種新型的Protein A原型填料，該填料具備在較溫和的pH條件下進(jìn)行洗脫的能力。具體來(lái)說(shuō)，研究人員通過(guò)對五個(gè)Protein A野生型結構域的序列片段進(jìn)行重組，創(chuàng )造出全新的Protein A樣序列，從而制備出一種“人造”的馬賽克式Protein A等價(jià)物。此外，通過(guò)在不同位置引入定點(diǎn)突變，構建了一個(gè)小型的突變庫，并從中篩選出具有更優(yōu)洗脫pH特性的配基。實(shí)驗結果表明，將野生型氨基酸替換為組氨酸可以最有效地提高洗脫pH。由于這些序列修改發(fā)生在Protein A分子的Fc和VH3結合區內，因此與野生型序列相比，在較溫和的酸性pH下，其結合親和力有所降低，但保留了在中性pH下的Fc結合親和力，以促進(jìn)產(chǎn)物的結合。通過(guò)篩選過(guò)程，研究人員確定了數種能夠在較溫和pH下洗脫的Protein A配基候選物。最終，選擇了兩種配基作為主要候選配基，它們均能在較溫和的pH下實(shí)現洗脫，同時(shí)保持較高的結合載量。盡管Protein A的主要結合活性是通過(guò)抗體的Fc部分實(shí)現的，但它也能以不同的模式與VH3結構域結合。這兩種候選配基在與抗體VH3結構域結合的能力上存在差異：其中一種候選配基僅對非VH3抗體表現出溫和的洗脫能力，而另一種候選配基則在VH3結合區含有額外的氨基酸突變，使其對VH3和非VH3抗體均具有溫和的洗脫能力。利用這兩種主要候選配基，研究人員制備了兩種原型填料，并對其性能進(jìn)行了評估，相關(guān)結果詳見(jiàn)本文。

隨后，Repligen和Navigo Proteins與Purolite合作，致力于將該原型填料進(jìn)行放大和商業(yè)化。該原型填料能夠對VH3和非VH3抗體均實(shí)現溫和的洗脫，并最終被商業(yè)化為Praesto® Jetted A50 HipH填料。Praesto® Jetted A50 HipH填料結合了Repligen的NGL-Impact A HipH配基，并采用了Purolite的噴射技術(shù)制造的Jetted A50基礎基質(zhì)。

隨著(zhù)抗體相關(guān)候選藥物組合的日益多樣化，對Protein A層析過(guò)程中更靈活的洗脫條件的需求也在不斷增長(cháng)。在本研究中，我們對兩種專(zhuān)為較溫和pH洗脫設計的Protein A填料（Jetted A50 HipH和原型HipH-002）進(jìn)行了評估，并將其與兩種廣泛使用的商用Protein A填料（Jetted A50和MabSelect SuRe）進(jìn)行了比較，主要考察了它們的洗脫pH、動(dòng)態(tài)結合載量（DBC）以及雜質(zhì)去除能力。此外，我們還通過(guò)穩定性研究，檢驗了洗脫pH對pH敏感分子的影響。

詳細的實(shí)驗操作和結果，請參考原文。

實(shí)驗中使用的填料的性質(zhì)

結果

脈沖注射實(shí)驗

對表中列出的四種 Protein A 填料進(jìn)行脈沖進(jìn)樣，然后以 pH 7.0 至 3.0 的線(xiàn)性 pH梯度進(jìn)行洗脫。如圖 1、圖 2所示，對于所有測試的分子，Jetted A50 HipH 和 HipH-002 填料的洗脫 pH 明顯高于現有的 Protein A 填料（Jetted A50 和 MabSelect SuRe）。

圖 1.Protein A 填料上 Fc1 的洗脫 pH 值，定義為 UV 峰最大值的pH 值，通過(guò) pH 7.0 至 3.0 的線(xiàn)性 pH 梯度脈沖注射確定。

圖 2. 5種mAb 在Protein A 填料上的洗脫 pH 值比較（定義為 UV 峰最大值的 pH 值），通過(guò)pH 7.0 至 3.0 的線(xiàn)性 pH 梯度脈沖注射確定。

圖 1顯示了線(xiàn)性 pH 梯度上 Fc1 洗脫曲線(xiàn)的 UV 軌跡。對于Fc1，在填料 Jetted A50 HipH 和HipH-002 上，洗脫峰最大值時(shí)的 pH 分別為 4.8 和 5.2。傳統Protein A 填料Jetted A50 和 MabSelect SuRe 的峰最大值分別為 pH 3.5 和 3.4。Fc1 是一種 Fc 融合蛋白，據觀(guān)察，在 pH 4.5 以下時(shí)聚體形成增加。使用傳統Protein A 填料時(shí)，需要低 pH 緩沖液來(lái)洗脫 Fc1，并且需要直接中和策略來(lái)最大限度地減少分子在低 pH 條件下的暴露時(shí)間。相比之下，本研究中評估的 HipH 填料提供了明顯更高的洗脫 pH，這使得可以直接回收穩定 pH 區域（> pH 4.5）內的 Fc1。

圖 2總結了所評估的5種 mAb 的洗脫 pH。對于所有分子，傳統Protein A 填料始終在 pH 3.4–3.7 下洗脫，表明需要低 pH 值才能打破 mAb 與傳統Protein A 配基之間的相互作用。Jetted A50 HipH 對mAb 2–5 顯示出非常一致的溫和洗脫 pH，洗脫峰最大值在pH 4.6 和 4.7 之間。研究中的一個(gè)例外是 mAb1，其洗脫峰最大值發(fā)生在 pH 4.2。這種差異可能歸因于 mAb1 的序列或結構，這導致 mAb 與 Jetted A50 HipH 配基之間產(chǎn)生更強的結合相互作用。HippH-002 對測試的 mAb 具有更多可變的洗脫 pH，洗脫峰最大值范圍為 pH 3.7 至 4.7。與 Jetted A50 HipH 填料相比，mAb 2、3 和 4 在 HipH-002 填料上的洗脫 pH 值較低，表明與 HipH-002 配基的結合親和力更強。這歸因于 HipH-002 配基的 VH3 結合親和力，因為這三種 mAb 均源自人 VH3 家族。此外，不同的 VH3 序列可能導致對相同配基的不同親和力，這可以解釋 mAb 2、3 和 4 在 HipH-002 上的洗脫pH 值差異。源自人 VH1 家族的 mAb 1 和 mAb 5 在 Jetted A50 HipH和 HipH-002 上具有相似的洗脫 pH 值。

實(shí)驗結果表明，由于對Jetted A50 HipH和HipH-002配基進(jìn)行了序列上的改良，這兩種填料均能在比傳統填料更溫和的pH條件下實(shí)現洗脫。原型HipH-002配基僅對非VH3抗體表現出穩定的洗脫性能，這是因為其對VH3區域的結合親和力可能因特定VH3序列的不同而存在更寬的洗脫pH范圍。相比之下，Jetted A50 HipH是一種更為通用的溫和洗脫pH填料，適用于所有含Fc的蛋白質(zhì)，不受IgG類(lèi)型或VH家族的限制。由于Jetted A50 HipH配基在VH3結合區引入了額外的突變，使其能夠溫和地洗脫VH3和非VH3抗體，因此與傳統Protein A填料相比，預計所有含Fc的蛋白質(zhì)都可以在更溫和的洗脫pH下實(shí)現洗脫。然而，對于每種目標蛋白質(zhì)，仍需進(jìn)行實(shí)際實(shí)驗以了解其具體的洗脫行為。在本研究中評估的6種蛋白質(zhì)中，有5種在pH 4.6以上從Jetted A50 HipH中洗脫，而所有蛋白質(zhì)均在pH 4.2以上洗脫。相比之下，Pabst等人評估了9種分子在12種市售傳統Protein A填料上的洗脫pH行為，發(fā)現大多數蛋白質(zhì)-填料組合的洗脫pH范圍為3.5-3.8。對于傳統Protein A填料而言，Fc結合親和力僅在低pH條件下（如<pH 4.0）降低，蛋白質(zhì)也只能在此pH以下洗脫。而HipH配基的修飾序列則在較溫和的酸性pH下降低了Fc結合親和力，從而允許在更溫和的pH條件下實(shí)現洗脫。

動(dòng)態(tài)結合載量

在6分鐘的保留時(shí)間內，使用四種Protein A填料測定了mAb1、mAb2和Fc1在10%穿透時(shí)的動(dòng)態(tài)結合載量（DBC）。表3總結了這三種分子在四種填料上獲得的DBC值。由于Fc1的分子量大約是典型單克隆抗體的一半，因此其每單位體積填料的蛋白質(zhì)質(zhì)量動(dòng)態(tài)結合載量預期較低。對于Fc1，Jetted A50 HipH和HipH-002的結合載量介于MabSelect SuRe和Jetted A50之間。需要注意的是，由于每種融合分子的設計都是獨特的，因此這些數據可能無(wú)法預測其他Fc融合蛋白的性能。對于mAb1和mAb2，Jetted A50 HipH和HipH-002展現出與Jetted A50相當的高動(dòng)態(tài)結合載量，且比MabSelect SuRe的動(dòng)態(tài)結合載量高出40-70%。這一結果在意料之中，因為HipH填料與Jetted A50共享相同的基礎填料基球。

表3.4種 Protein A 填料上 mAb 和Fc 融合蛋白的動(dòng)態(tài)結合載量。

高分子量（HMW）餾分的梯度洗脫實(shí)驗

盡管Protein A層析通常不降低高分子量（HMW）雜質(zhì)的水平，但先前的研究指出，通過(guò)線(xiàn)性pH梯度洗脫可以實(shí)現聚體和單體的分離，因為聚體對配基的親和力更強。然而，在傳統Protein A填料上，找到一個(gè)穩定的操作空間以選擇性地洗脫單體是非常具有挑戰性的。

圖3展示了四種Protein A填料在20個(gè)柱體積（CV）洗脫梯度過(guò)程中，Fc1的紫外（UV）吸收軌跡，其中pH值逐漸降低。色譜圖上疊加的圖表顯示了各餾分中收集的累積高分子量（HMW）雜質(zhì)回收率。對于所有四種Protein A填料，UV軌跡上均出現了一個(gè)后肩，表明后續餾分中含有較高比例的HMW雜質(zhì)，這說(shuō)明HMW雜質(zhì)與填料的結合更為牢固，需要更低的pH值才能實(shí)現洗脫。由于HipH填料能夠在較溫和的pH條件下實(shí)現洗脫，因此與現有的Protein A填料相比，其在單體和聚體的分離度上表現得更為出色。表4比較了UV峰最大值出現時(shí)的pH值（代表大多數蛋白質(zhì)洗脫的位置）以及實(shí)現50% HMW雜質(zhì)去除的pH值，后者相當于累積HMW雜質(zhì)回收率達到50%。在這兩個(gè)pH值之間進(jìn)行洗脫，可以在獲得高蛋白質(zhì)回收率的同時(shí)，實(shí)現超過(guò)50%的HMW雜質(zhì)去除率。對于HipH填料，UV峰最大值和50% HMW雜質(zhì)去除率之間的pH差異為0.6個(gè)pH單位，而傳統填料的pH差異僅為0.3個(gè)pH單位。HipH填料的pH差異較大，表明單體與聚體之間的結合親和力差異更為顯著(zhù)，從而為提高該純化步驟的純度提供了更大的操作空間。

圖 3. Protein A 填料上 Fc1 的紫外吸光度和累積 HMW 回收率。所有運行均采用 20 CV 下降線(xiàn)性梯度，Jetted A50 HipH 和 HipH-002 從 pH 7.0 下降至 3.0，Jetted A50 和MabSelect SuRe 從 pH 4.5 下降至 3.0。收集餾分以測量每個(gè)餾分中的 HMW 水平，并計算與上樣中的 HMW 相比的累積洗脫 HMW。

表4. 在4種Protein A 填料上使用線(xiàn)性梯度分離 HMW。

較溫和的洗脫pH填料為洗脫條件提供了更寬的操作范圍，從而使得在Protein A層析過(guò)程中能更有效地去除高分子量（HMW）雜質(zhì)。洗脫pH可根據分子特性進(jìn)一步優(yōu)化，以在收率和HMW雜質(zhì)去除之間達到最佳平衡。在Protein A捕獲步驟中顯著(zhù)降低HMW雜質(zhì)含量，可減輕后續精純步驟的雜質(zhì)去除壓力，進(jìn)而提升整個(gè)下游工藝的效率。

等度洗脫評價(jià)

根據線(xiàn)性梯度上 mAb1 和 Fc1 的洗脫峰最大 pH 值，對它們進(jìn)行了等度洗脫運行，評估了幾種不同的洗脫 pH 值。每次運行的載量為 DBC 載量的 85%，穿透率為 10%。

圖 4總結了等度洗脫實(shí)驗中的單體收率和洗脫液 HMW 結果。圖中顯示的是單體收率，而不是總收率，以考慮被去除的聚體量。

圖 4. 使用Fc1 和 mAb1 在Protein A 填料上進(jìn)行等度洗脫實(shí)驗時(shí)單體收率和洗脫液 HMW 水平。Fc1 測試了 5 個(gè)洗脫 pH，最高 pH 為 5.5；mAb1 測試了 4 個(gè)洗脫 pH，最高 pH 為 4.4。上樣中的起始 HMW水平為 Fc1 的 7.1% 和 mAb1 的 8.7%。由于產(chǎn)物回收率低，沒(méi)有對所有 Jetted A50 和 MabSelect SuRe 洗脫液進(jìn)行 HMW 測量。

圖4左側的圖表匯總了Fc1的等度洗脫實(shí)驗結果，洗脫緩沖液的pH值分別為5.5、5.2、4.9、4.6和3.5。對于HipH-002填料，在洗脫pH值為5.2或更低時(shí)，單體收率超過(guò)88%。在pH值5.5和5.2時(shí)，HipH-002的收率高于Jetted A50 HipH。這一觀(guān)察結果與脈沖注射和梯度洗脫數據相一致，其中HipH-002的洗脫峰最大pH值高于Jetted A50 HipH。正如預期，Jetted A50和MabSelect SuRe僅在洗脫pH值為3.5時(shí)才能實(shí)現高收率。需要低pH值才能將分子從傳統的Protein A填料上洗脫，但這也會(huì )導致結合在柱上的HMW雜質(zhì)一同洗脫，使得HMW雜質(zhì)的去除率極低。相比之下，在Jetted A50 HipH和HipH-002上使用pH 5.2進(jìn)行洗脫，可獲得高Fc1收率，且洗脫液中的HMW雜質(zhì)水平分別從上樣中的7.1%降低至2.0%和2.9%。這表明HipH填料具有額外的優(yōu)勢，即通過(guò)擴大洗脫pH范圍來(lái)改善聚體的去除。

圖4右側的圖表匯總了使用pH值為4.4、4.2、4.0和3.5的洗脫緩沖液對mAb1進(jìn)行等度洗脫實(shí)驗的結果。當洗脫pH值為4.4或更低時(shí)，HipH填料的單體收率超過(guò)90%。在pH 4.4時(shí)，Jetted A50 HipH的收率略高于HipH-002，這與脈沖注射數據一致，其中Jetted A50 HipH的洗脫峰最大pH略高于HipH-002。與Fc1類(lèi)似，使用Jetted A50和MabSelect SuRe純化mAb1時(shí)，僅在采用pH為3.5的洗脫緩沖液時(shí)才能獲得高收率，但此時(shí)HMW雜質(zhì)的去除率極低。相比之下，當在Jetted A50 HipH和HipH-002上以pH 4.4進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫液中的HMW雜質(zhì)水平分別從上樣中的8.7%降低至4.7%和4.2%。

在后續討論的實(shí)驗中，針對每種分子選擇具有最溫和洗脫pH值的HipH填料，用于洗滌緩沖液的篩選，并利用澄清的細胞培養收獲物來(lái)評估工藝性能和產(chǎn)物質(zhì)量。具體而言，對于Fc1的純化，進(jìn)一步在HipH-002上進(jìn)行評估；而對于mAb1的純化，則進(jìn)一步在Jetted A50 HipH上進(jìn)行評估。

洗滌條件評估

Protein A層析對含Fc蛋白具有高選擇性和親和力，有望高效清除工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主細胞蛋白（HCP）?？梢酝ㄟ^(guò)使用不同的添加物或調節pH值的中間洗滌步驟來(lái)增強對松散結合的HCP甚至難以去除的HCP的清除效果。這被證明是減輕后續精純步驟負擔的關(guān)鍵有效方法。因此，本文評估了表5和表6中列出的Protein A層析常用洗滌緩沖液在HipH填料上清除HCP的效果及其對產(chǎn)量的影響。此次評估的目的是確定，在HipH填料的結合親和力發(fā)生變化的情況下，使用傳統洗滌緩沖液是否仍能有效清除HCP并實(shí)現高回收率。

表5.不同洗滌緩沖液對Fc1的收率和宿主細胞蛋白清除率的影響。

表6.不同洗滌緩沖液對mAb1收率和宿主細胞蛋白清除率的影響

在HipH-002上對Fc1進(jìn)行洗滌評估實(shí)驗，使用表5所示的8種不同洗滌劑各三個(gè)柱體積，并采用pH為5.2的洗脫緩沖液。每次運行的收率均標準化為無(wú)洗滌對照運行的收率，以確定洗滌步驟導致的具體收率損失。50 mM辛酸鈉與1 M精氨酸（pH 7.0）的組合以及1 M精氨酸（pH 6.5）的組合可實(shí)現最高的HCP清除率。這一結果與之前在傳統Protein A填料上清除Fc1的HCP的經(jīng)驗相符。為了在收率和HCP清除率之間取得平衡，50 mM辛酸鈉和1 M精氨酸（pH 7.0）被確定為Fc1 HCP清除的最佳洗滌劑組合。同樣，在Jetted A50 HipH上對Fc1進(jìn)行了洗滌緩沖液篩選，使用相同的洗脫緩沖液pH 5.2和表5所示的洗滌緩沖液，顯示出與HipH-002相似的收率和HCP去除趨勢。然而，與HipH-002上的運行相比，Jetted A50 HipH上所有運行的收率略低（數據未展示），這與等度洗脫評估的預期一致。

此外，當采用1 M pH 6.0的精氨酸作為洗滌緩沖液時(shí)，洗滌過(guò)程中的收率損失達到65%。這一結果表明，高濃度的精氨酸和較低的pH值在削弱蛋白質(zhì)與配基之間的相互作用方面發(fā)揮了重要作用。這也意味著(zhù)，若需采用更溫和的pH值，可在溫和洗脫pH填料上添加精氨酸等改性劑，以進(jìn)一步提升洗脫pH值。

對于mAb1，在Jetted A50 HipH上使用表6中所示的6種洗滌緩沖液各三倍柱體積，并采用pH為4.4的洗脫緩沖液進(jìn)行洗滌評估實(shí)驗。初步研究表明，使用pH為6.5的洗滌緩沖液會(huì )導致顯著(zhù)的收率損失，因此這些緩沖液未被包含在mAb1的洗滌評估中。含有1 M精氨酸和50 mM辛酸鈉的洗滌條件與無(wú)洗滌運行相比導致收率損失，并展示了HCP去除與回收率之間的權衡。為了在收率和HCP清除率之間取得平衡，確定pH為7.0的0.5 M精氨酸是mAb1 HCP清除的最佳洗滌劑。同樣，在HipH-002上對mAb1進(jìn)行了洗滌緩沖液篩選，使用相同的pH為4.4的洗脫緩沖液和表6中所示的洗滌緩沖液，顯示出與Jetted A50 HipH相似的收率和HCP去除趨勢。然而，與Jetted A50 HipH上的運行相比，HipH-002上所有運行的收率都略低，這與等度洗脫評估的預期一致。

總體而言，這些結果表明，在傳統Protein A填料上用于清除宿主細胞蛋白（HCP）的常用洗滌緩沖液也能成功地去除溫和洗脫pH填料上的HCP。由于與HCP的相互作用具有分子特異性，因此需要針對每種目標蛋白確定最佳的洗滌緩沖液。pH低于7.0的洗滌緩沖液可能有助于提高HCP去除率，但通常會(huì )以降低收率或上樣密度為代價(jià)，因為在這些洗滌條件下，蛋白質(zhì)可能會(huì )被部分洗脫。

在優(yōu)化條件下純化澄清的細胞培養物

對澄清的細胞培養收獲物進(jìn)行純化，以評估與傳統填料相比，溫和洗脫pH Protein A層析填料在最佳條件下對Fc1和mAb1的選擇性純化能力。Fc1在HipH-002上進(jìn)行純化，洗脫pH設定為5.2；mAb1則在Jetted A50 HipH上進(jìn)行純化，洗脫pH設定為4.4。將這些經(jīng)過(guò)優(yōu)化的溫和洗脫運行結果與在Jetted A50和MabSelect SuRe上、洗脫pH為3.5的純化運行結果進(jìn)行比較。所有Fc1的運行過(guò)程中均加入了50 mM辛酸鈉和1 M精氨酸（pH 7.0）的中間HCP洗滌液；所有mAb1的運行過(guò)程中均加入了0.5 M精氨酸（pH 7.0）。

表7總結了在最佳溫和洗脫pH填料上純化后洗脫液的工藝性能和產(chǎn)物質(zhì)量，并將其與兩種傳統Protein A填料進(jìn)行了比較。對于Fc1，HipH-002上的收率與兩種傳統Protein A填料相當，后者的洗脫液中HMW水平較低。這是因為HipH-002上的洗脫pH更高，且柱上HMW物質(zhì)與單體的分離效果更好。使用pH 5.2的洗脫緩沖液時(shí)，洗脫pH低于梯度實(shí)驗中UV峰最大值出現的pH（pH 5.7），從而實(shí)現了蛋白質(zhì)的高回收率。pH 5.2也高于發(fā)生50% HMW去除的pH（pH 5.0），這表明在該洗脫pH下，大部分HMW仍然與柱結合，從而在Protein A步驟中更有效地去除了HMW。此外，與傳統Protein A填料相比，HipH-002的HCP清除率相當。

表7. 細胞培養收獲物純化的工藝性能和洗脫產(chǎn)物質(zhì)量。

對于mAb1，在Jetted A50 HipH上的收率相較于傳統Protein A填料大約低了10%。在此次使用細胞培養材料作為上樣的運行中，觀(guān)察到洗滌步驟中存在收率損失，推測這可能是由于分子與配基之間的結合強度減弱所致。而當使用Protein A洗脫液作為上樣材料時(shí)，在相同的洗滌和洗脫條件下，洗滌步驟中的收率損失最小。這表明，使用細胞培養材料而非純化蛋白作為上樣的等度洗脫和洗滌評估實(shí)驗，可能會(huì )對收率方面的最佳洗滌和洗脫緩沖液選擇得出不同的結論。此外，由于洗脫pH緩沖液較為溫和，Jetted A50 HipH上的洗脫液峰出現拖尾現象，導致峰收集不完整，從而使得收率較低。采用pH稍低的洗脫緩沖液或增加洗脫體積可以提高回收率。相比之下，Jetted A50或MabSelect SuRe在中間洗滌中沒(méi)有損失，其洗脫峰非常尖銳。與Fc1類(lèi)似，Jetted A50 HipH的洗脫pH值較高（4.4），有助于提高HMW清除率，使得結合力更強的HMW物質(zhì)留在柱上。Jetted A50 HipH上的HCP清除率也與傳統Protein A填料相當。

表7僅展示了使用最溫和洗脫pH的最佳HipH填料的結果，以凸顯其優(yōu)勢。此外，還使用與最佳HipH填料相同的洗脫和洗滌緩沖液，在Jetted A50上對Fc1進(jìn)行細胞培養純化，在HipH-002上對mAb1進(jìn)行細胞培養純化，結果表明HipH填料能夠在比傳統Protein A填料更溫和的pH條件下實(shí)現洗脫，同時(shí)有效去除HMW和HCP雜質(zhì)。然而，與HipH-002相比，Jetted A50 HipH上使用Fc1的收率略低；與Jetted A50相比，在HipH-002上使用mAb1的產(chǎn)量略低，這與等度洗脫評估的預期一致。因此，需要針對每種目標蛋白質(zhì)和每種填料確定最佳的緩沖液和運行條件，以在收率、雜質(zhì)去除和洗脫液pH（如有必要）之間取得最佳平衡。

Protein A層析通常不用于去除高分子量（HMW）雜質(zhì)，因為疏水相互作用層析（HIC）和陽(yáng)離子交換層析（CEX）等模式在這方面更為有效。然而，在工藝早期去除雜質(zhì)有助于減輕后續精純步驟的負擔，從而實(shí)現更高的上樣量和提高收率。盡管已有研究證明Protein A層析能夠分離HMW和單體，但所需條件往往導致收率不理想或需要添加鹽。由于回收率低或與后續步驟的工藝連接困難，這兩種選擇對于大規模生產(chǎn)來(lái)說(shuō)都是不理想或不可行的。使用標準Protein A方案，HipH填料能夠顯著(zhù)降低HMW含量并獲得可接受的收率，只需改變洗脫pH值即可。

洗脫pH對pH敏感分子的影響

在上一節中討論的HipH-002、Jetted A50和MabSelect SuRe細胞培養運行中，天然Fc1洗脫物的穩定性在48小時(shí)內進(jìn)行了評估。HipH-002使用pH 5.2的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，而Jetted A50和MabSelect SuRe則使用pH 3.5的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。

表7展示了洗脫完成后10分鐘內測定的Fc1天然洗脫液的pH值和洗脫液中的HMW水平。從圖5可以看出，與HipH-002相比，Jetted A50和MabSelect SuRe的天然洗脫液起始HMW水平更高。這可能是由于在柱上發(fā)生或快速聚集和HMW分離的結合所致。已知Fc1在pH低于4.5時(shí)不穩定。因此，在Jetted A50和MabSelect SuRe上使用低pH洗脫可能會(huì )導致在柱洗脫時(shí)以及收集的洗脫液中發(fā)生聚集，因為天然洗脫液的pH值分別為3.7和3.9。此外，由于HMW與柱的結合更強，與傳統Protein A填料（將HMW與產(chǎn)物一起洗脫）所需的低pH值洗脫相比，HipH-002上較溫和的pH值洗脫可以選擇性地洗脫產(chǎn)物，而保持HMW結合。傳統的Protein A洗脫液在低pH下48小時(shí)內不穩定，Jetted A50洗脫液的HMW從4.9%增加到9.1%，MabSelect SuRe洗脫液的HMW從8.3%增加到16.4%。相比之下，天然HipH-002洗脫液的pH高于4.5，HMW水平在48小時(shí)內保持穩定。由于HipH填料可以用較溫和的洗脫pH洗脫，因此Protein A洗脫液的純度和穩定性都有所提高。

圖 5.天然 Fc1 Protein A 洗脫物的穩定性。使用 HipH-002、Jetted A50 和 MabSelect SuRe 在優(yōu)化條件下從澄清細胞培養液中純化后 48 小時(shí)內天然 Fc1 Protein A 洗脫物的 HMW 水平比較。

Jetted A50 HipH 實(shí)施注意事項

為了加速工藝開(kāi)發(fā)進(jìn)程，公司通常采用適用于大多數產(chǎn)物的平臺工藝。借助易于理解和模板化的工藝，可以大幅減少時(shí)間和資源投入，其中每個(gè)分子僅需優(yōu)化少數參數。Protein A層析通常是平臺工藝中的首個(gè)層析步驟，因為它能夠選擇性地捕獲和濃縮細胞培養物中的產(chǎn)物。然而，對于那些在低pH下容易聚集的復雜蛋白質(zhì)（如某些非典型單克隆抗體），它們可能無(wú)法很好地適應標準的平臺工藝，從而迫使工藝偏離既定流程，并顯著(zhù)增加工藝開(kāi)發(fā)時(shí)間。Jetted A50 HipH作為平臺Protein A填料的主要候選者，其優(yōu)勢在于能夠適用于任何含Fc的蛋白質(zhì)，無(wú)論其對低pH的敏感性如何，并且只需對上樣、洗脫和洗脫階段的緩沖液及體積進(jìn)行優(yōu)化。溫和的洗脫pH運行條件帶來(lái)了更寬廣的操作范圍，但與傳統Protein A填料通常呈現的尖銳且濃縮的洗脫液峰相比，可能會(huì )出現洗脫峰拖尾和洗脫液收集量增加的情況。在確定最優(yōu)操作條件時(shí)，需要權衡收率、HMW清除率、天然洗脫液pH和洗脫體積等因素，以實(shí)現最佳性能和收率的平衡。相較于使用傳統Protein A填料，這可能會(huì )略微增加該Protein A步驟的開(kāi)發(fā)時(shí)間，但從純度角度來(lái)看是有益的。Jetted A50 HipH可以輕松替代平臺工藝中現有的Protein A填料，并與現有的下游工藝無(wú)縫集成。

Protein A填料（包括Jetted A50 HipH）面臨的主要挑戰之一是其壽命和可清潔性，而填料的高成本使得這一問(wèn)題更加突出。收率和結合載量的下降通常歸因于在清潔過(guò)程中填料暴露于堿性條件下導致的配基水解，以及雜質(zhì)的積累導致填料污染。本研究未對填料循環(huán)進(jìn)行評估。供應商聲稱(chēng)，Jetted A50 HipH在暴露于0.1 M氫氧化鈉120小時(shí)后仍能保持出色的載量（>85%初始動(dòng)態(tài)結合載量，DBC）。這與MabSelect SuRe LX相比要低得多，后者在配基水解研究中，填料在暴露于0.1 M氫氧化鈉約250小時(shí)后仍能保持容量（>85%初始DBC）。填料壽命與成本直接相關(guān)，因為填料的成本可以在各個(gè)循環(huán)中分攤，填料壽命越短，每個(gè)循環(huán)的填料成本就越高。在填料壽命研究中，必須同時(shí)評估填料污染和配基水解，以評估在代表性工藝條件下的填料循環(huán)，因為雜質(zhì)可以非特異性地與填料結合，阻礙與配基的接觸。與僅評估配基水解的研究相比，同時(shí)評估污染和配基水解的填料壽命研究觀(guān)察到載量和收率下降得更快、更嚴重，這表明與配基水解相比，填料污染在降低結合載量方面起著(zhù)更重要的作用。然而，填料污染和配基水解的速率取決于細胞培養基、堿再生溶液和每個(gè)循環(huán)的接觸時(shí)間。因此，需要對每個(gè)分子和填料進(jìn)行完整的柱循環(huán)研究，以確定在代表性工藝條件下的填料壽命。

結論

與傳統的Protein A填料Jetted A50和MabSelect SuRe相比，兩種溫和洗脫pH的Protein A填料Jetted A50 HipH和原型HipH-002成功地在較溫和的pH條件下洗脫了6種分子。新商業(yè)化的Jetted A50 HipH填料展現出更廣泛的溫和洗脫特性，大多數評估的蛋白質(zhì)的洗脫pH達到4.6或更高，預計能夠在比傳統Protein A填料更溫和的pH下成功洗脫所有含Fc的蛋白質(zhì)。HipH填料不僅具有與傳統Protein A填料相當的高結合載量和回收率，還表現出使用典型清洗去除雜質(zhì)的能力，從而可以無(wú)縫集成到傳統的Protein A純化平臺工藝中。對于那些在低pH下不穩定而無(wú)法使用傳統Protein A層析的蛋白質(zhì)，這項技術(shù)將帶來(lái)極大的益處，因為蛋白質(zhì)可以在溫和的pH下洗脫，避免暴露于低pH條件。在溫和pH下洗脫的能力將避免在洗脫緩沖液中使用改性劑或直接中和，從而實(shí)現更好的工藝連接和設備適配，并且所需的生產(chǎn)控制不那么嚴格。對于所有蛋白質(zhì)，即使在低pH下穩定，HipH填料也能提供更寬的操作窗口，這可以顯著(zhù)改善HMW雜質(zhì)的去除，減輕后續精純步驟的雜質(zhì)負擔。對于那些希望使用熟悉的Protein A工藝，并且能夠靈活地兼容所有含Fc蛋白質(zhì)（無(wú)論是不穩定的還是穩定的）的填料的人來(lái)說(shuō)，Jetted A50 HipH是平臺Protein A層析填料的理想選擇。

參考資料：

F.A.S.Wang, Y.Fan, W.K.Chung, et al., Evaluation of mild pH elution protein A resins for antibodies and Fc-fusion proteins. Journal of Chromatography A, 2024.