摘要：

在生物醫藥研究、診斷和不同療法中使用的重組蛋白大多是在制藥工業(yè)中的中國倉鼠卵巢細胞中生產(chǎn)的。這些生物治療藥物，特別是單克隆抗體，在過(guò)去幾十年中顯示出顯著(zhù)的市場(chǎng)增長(cháng)。對大量生物制劑日益增長(cháng)的需求要求不斷優(yōu)化和改進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)。研究旨在發(fā)現更好的手段和方法以達到更高的體積容量，同時(shí)保持穩定的產(chǎn)品質(zhì)量。越來(lái)越多的復雜新型蛋白治療藥物，如病毒抗原、疫苗、雙特異性和三特異性單克隆抗體，目前正進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)管線(xiàn)。這些生物分子在許多情況下難以表達，需要針對產(chǎn)品特定的解決方案來(lái)改善它們的瞬時(shí)或穩定生產(chǎn)。所有這些要求推動(dòng)了更高效表達優(yōu)化系統和高通量篩選平臺的發(fā)展，以促進(jìn)產(chǎn)品特定的細胞系工程和生產(chǎn)策略的設計。在這篇簡(jiǎn)評中，我們提供了關(guān)于CHO細胞系開(kāi)發(fā)、靶向基因操作技術(shù)、選擇系統和目前在重組蛋白生產(chǎn)中使用的篩選方法的最新進(jìn)展的概述。

1.介紹

生物治療藥物和診斷（治療診斷學(xué)）是制藥市場(chǎng)中迅速增長(cháng)的產(chǎn)品。它們包括各種單克隆抗體（mAbs）、疫苗、激素和其他蛋白質(zhì)，所有這些都有廣泛的應用。自2002年以來(lái)，美國食品藥品監督管理局（FDA）已批準了300多種生物制藥，并且這一數字還在增長(cháng)，因為生物制劑（蛋白質(zhì)、核酸、糖及其復合物）正在進(jìn)入診斷和治療的越來(lái)越多的領(lǐng)域。滿(mǎn)足這些產(chǎn)品日益增長(cháng)的需求仍然是一個(gè)挑戰，并推動(dòng)了制造過(guò)程中的不斷創(chuàng )新。策略旨在優(yōu)化蛋白質(zhì)表達，以實(shí)現更高的體積生產(chǎn)率，同時(shí)保持穩定的產(chǎn)品質(zhì)量和較低的制造成本，并縮短時(shí)間?？捎玫纳镏苿┲泻艽笠徊糠质侵亟M蛋白，其中大多數是在哺乳動(dòng)物表達平臺中生產(chǎn)的。在這篇綜述中，我們專(zhuān)注于這個(gè)表達系統，盡管還有其他系統可用于生產(chǎn)活性重組蛋白，并正在評估其在制藥工業(yè)中的潛在應用。哺乳動(dòng)物細胞傾向于成為工業(yè)生物制藥生產(chǎn)的主導宿主，主要是因為它們能夠產(chǎn)生多樣化、正確折疊和糖基化的蛋白質(zhì)。在過(guò)去十年中，翻譯后修飾的重要性，特別是糖基化，以及它們如何影響重組蛋白的不同屬性的問(wèn)題，引起了廣泛關(guān)注。廣泛的研究導致發(fā)現，為了潛在的治療用途，大型和復雜的蛋白質(zhì)需要具有類(lèi)似人類(lèi)的翻譯后修飾，才能具有功能性和非免疫原性。不同小組的幾項研究表明，適當的糖基化輪廓促進(jìn)生物活性和穩定性，增加半衰期并減少蛋白質(zhì)治療藥物的免疫原性。

2.用于制藥重組蛋白表達的CHO表達平臺

基于哺乳動(dòng)物表達的系統涉及各種不同來(lái)源的細胞系，包括倉鼠（CHO, BHK）、人類(lèi)（HEK293, HT-1080, PER.C6, CAP, HKB-11, Huh-7）和小鼠（NS0, Sp2/0）。然而，70%的生物制劑，幾乎所有的單克隆抗體，都是在倉鼠卵巢（CHO）細胞中生產(chǎn)的，作為生物制藥蛋白生產(chǎn)的最常用和首選宿主。它們的流行在于它們能夠高生產(chǎn)率（批培養中0.1–1 g/L，在補料批培養中1–10 g/L），表現出一致的良好生長(cháng)表型，適合大規模工業(yè)培養，可以輕松適應各種化學(xué)定義的培養基，對人類(lèi)病毒的感染不太敏感，并且能夠進(jìn)行與人類(lèi)兼容的糖基化。CHO ori細胞系是由Theodore Puck在1956年分離和永生化的。然后通過(guò)引入突變或適應不同的培養條件進(jìn)一步開(kāi)發(fā)亞克隆。與親本細胞系相比，CHO ori衍生的細胞系具有特定的屬性，更有利于高效蛋白質(zhì)生產(chǎn)或生產(chǎn)者細胞系的建立。CHO DXB11 (dhfr+/), CHO DG44 (dhfr/) 和 CHO-GS-/- (CHO-K1SV)宿主已經(jīng)生成，通過(guò)利用代謝標記，即二氫葉酸還原酶介導的甲氨蝶呤（MTX）基礎和谷氨酰胺合成酶介導的甲硫氨酸亞砜胺（MSX）基礎選擇系統，使克隆選擇更容易和更快。同時(shí)，MTX選擇也作為一種基因擴增系統，允許高產(chǎn)品產(chǎn)量。CHO-S及其衍生細胞系已經(jīng)適應懸浮培養，目的是通過(guò)增加生產(chǎn)者細胞密度來(lái)實(shí)現更高的體積生產(chǎn)。盡管共享相同的共同祖先，不同的CHO譜系由于廣泛的誘變和克隆選擇表現出顯著(zhù)的遺傳異質(zhì)性。這些遺傳差異，也影響核型和表觀(guān)遺傳變異，解釋了最廣泛使用的CHO細胞系（主要是CHO-K1, CHO DXB11, CHO-S和CHO DG44）之間的宿主細胞特異性差異。因此，CHO表達平臺為宿主細胞選擇和蛋白質(zhì)生產(chǎn)優(yōu)化提供了廣泛的選擇。不同小組的比較研究提供了大量關(guān)于不同重組CHO細胞系對各種生物制劑的細胞特異性生長(cháng)和產(chǎn)品形成的數據。在一個(gè)代表性例子中，Reinhart等人已經(jīng)表明，CHO-K1細胞更傾向于細胞特異性生產(chǎn)力（7–16 pg/cell/day），而CHO-S更傾向于生物質(zhì)生產(chǎn)，但單克隆抗體表達較低（2–6 pg/cell/day），這與CHO DG44細胞相似（在相同的實(shí)驗設置中為2–4 pg/cell/day）。該小組還研究了CHO宿主對不同培養條件（批培養、補料批培養、半連續灌注培養）和化學(xué)定義培養基的偏好。研究得出結論，觀(guān)察到的表達差異與宿主細胞特異性表型和代謝有關(guān)，并與培養方法或細胞培養培養基沒(méi)有很強的相關(guān)性。

3.CHO細胞系優(yōu)化——歷史視角

數十年來(lái)，世界各地的研究團隊都投入了巨大努力，試圖提高生產(chǎn)者CHO細胞系的性能。這些細胞系操作的嘗試旨在實(shí)現更高的生產(chǎn)力和產(chǎn)品產(chǎn)量，并利用了關(guān)于轉錄、翻譯、細胞代謝、信號通路和分泌機制的現有知識。宿主細胞工程的主要策略是基于過(guò)表達有利于細胞增殖、長(cháng)壽、應激和凋亡抵抗、蛋白質(zhì)生產(chǎn)和分泌的基因。眾多研究表明，瞬時(shí)或穩定過(guò)表達參與細胞代謝、蛋白質(zhì)生物合成和糖基化的關(guān)鍵基因可分別提高生長(cháng)速率、生產(chǎn)力，并獲得更好的產(chǎn)品質(zhì)量。通過(guò)過(guò)表達各種轉錄因子、抗凋亡（例如BCL2、XIAP、AVEN、MCL1）和促增殖基因，也已證明細胞活力和培養性能得到改善。蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步也為宿主細胞的合理工程做出了貢獻。蛋白質(zhì)組學(xué)數據的分析被用來(lái)識別基因操作的潛在靶點(diǎn)，以提高產(chǎn)品產(chǎn)量，如谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞單位的報道。與有益基因的強制表達相反，其他細胞系優(yōu)化方法側重于通過(guò)基因組敲除或通過(guò)RNAi介導的基因沉默來(lái)消除或抑制“不利”基因。破壞基因功能或消除基因產(chǎn)物有不同方式：i）通過(guò)靶向基因組操作部分或完全刪除特定基因，ii）通過(guò)突變“關(guān)閉”基因功能，iii）siRNA介導的基因沉默。微RNA（miRNA），已知在哺乳動(dòng)物細胞的轉錄組調控中起著(zhù)關(guān)鍵作用，在過(guò)去十年中也已深入研究其在CHO細胞工程中的潛力。越來(lái)越多的證據表明，miRNA對諸如轉錄、翻譯、核糖體生物合成、分泌、細胞周期、代謝和細胞死亡等多個(gè)細胞功能有影響。因此，利用miRNA調控系統代表了一種高效分子工具，可用于整個(gè)細胞途徑的工程。miRNA過(guò)表達（例如miR-2861、miR-23、miR-17）或通過(guò)抗miRNA、病毒載體、海綿和tough decoy載體（例如miR-7、miR-106b、miR-14等許多其他）敲低，已在CHO細胞系優(yōu)化中成功使用，以使細胞適應應激環(huán)境、溫度變化并增強蛋白質(zhì)生產(chǎn)。最近一項研究報道了使用CRISPR/Cas9基因組編輯系統刪除miR-744，目的是提高CHO生物過(guò)程性能。操縱miRNA介導的調控也已應用于提高人工設計的難以表達的新生物治療劑的生產(chǎn)。歷史上，基因消減研究針對的是代謝（例如LDHA）、促凋亡（BAX、BAK）和抗增殖基因，以及細胞周期檢查點(diǎn)激酶（ATR）。正如預期的那樣，這些選定基因的消除或沉默導致培養性能改善、凋亡抵抗增強和產(chǎn)品產(chǎn)量提高。參與染色質(zhì)重塑（例如HDACs）和糖基化（例如FUT8、SLC35C1）的基因也成為敲除研究的靶點(diǎn)，以更好地了解如何操縱細胞系以表達具有定制翻譯后修飾譜的重組蛋白。所有這些宿主細胞工程的成就都被視為成功故事，因為它們導致了CHO宿主衍生物的產(chǎn)生，這些衍生物在生長(cháng)、應激抵抗和生產(chǎn)力方面超過(guò)了它們的親本細胞系。工程生產(chǎn)細胞系已被證明能夠實(shí)現創(chuàng )紀錄的高3–7 g/L體積生產(chǎn)力。然而，監測工業(yè)制造中生產(chǎn)效率的數據表明，在許多情況下，不可能從高滴度生產(chǎn)過(guò)程的生物反應器中回收全部產(chǎn)品。由于這個(gè)下游處理瓶頸，產(chǎn)品似乎并未從非常高滴度中受益，進(jìn)一步提高滴度的努力可能帶來(lái)收益遞減。此外，在許多情況下，觀(guān)察到重組細胞系在長(cháng)期培養過(guò)程中活力和生產(chǎn)力下降，從而使工業(yè)界面臨進(jìn)一步挑戰。

4.工業(yè)細胞系開(kāi)發(fā)的新焦點(diǎn)領(lǐng)域

在2010年之前，許多生物制藥公司遵循開(kāi)發(fā)自己的生產(chǎn)細胞系的政策，但過(guò)去十年中這種方法發(fā)生了變化?，F在公司傾向于使用相同的宿主細胞系進(jìn)行生產(chǎn)和初期臨床試驗，因為他們意識到這種策略簡(jiǎn)化了細胞系開(kāi)發(fā)周期，并優(yōu)化了通往臨床的道路。此外，它降低了產(chǎn)品可比性問(wèn)題的風(fēng)險，并幫助制造商滿(mǎn)足產(chǎn)品質(zhì)量要求和一致性預期。這些變化的優(yōu)先事項促成了CHO表達平臺創(chuàng )新的新方向。工業(yè)細胞系開(kāi)發(fā)的焦點(diǎn)已轉向宿主細胞系穩定性問(wèn)題，以確保穩定的長(cháng)期生產(chǎn)，使用靶向整合技術(shù)進(jìn)行表達優(yōu)化，特別是對于復雜的工程重組治療劑，以及開(kāi)發(fā)選擇和篩選系統，以實(shí)現更快、更有效的克隆選擇（圖1）。

圖1. 工業(yè)細胞系開(kāi)發(fā)中創(chuàng )新研究的當前重點(diǎn)領(lǐng)域。

4.1.CHO細胞系不穩定性

在制藥行業(yè)中使用的CHO細胞，以良好的適應遺傳操作和改變培養條件的能力而著(zhù)稱(chēng)。這一特點(diǎn)源于這些細胞系本身具有可塑性的基因組，這使得它們適合于大規模工業(yè)生產(chǎn)。然而，不利的是，這種細胞可塑性使得CHO細胞更容易發(fā)生基因組重排（缺失、易位），并在生物生產(chǎn)過(guò)程中成為細胞系不穩定的源頭。生產(chǎn)細胞面臨著(zhù)高基因組和代謝需求，可能導致基因組和表觀(guān)遺傳變化，從而導致生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量下降。盡管如此，CHO細胞系提供的眾多優(yōu)勢使它們成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主，因此，科學(xué)和工業(yè)界在近期內不太可能放棄這一表達系統。因此，最近已投入大量努力來(lái)理解CHO細胞系不穩定的這一現象。研究重點(diǎn)是尋找解決方案，以克服制造過(guò)程中表型不穩定的難題，確保長(cháng)期穩定的生產(chǎn)、過(guò)程一致性，并確保產(chǎn)品質(zhì)量可接受。與所有其他快速生長(cháng)的永生化細胞一樣，CHO宿主細胞系在基因組上不穩定且克隆內異質(zhì)，這賦予了系統魯棒性和靈活性，但導致生產(chǎn)穩定性問(wèn)題。為了更好地理解CHO細胞的異質(zhì)性，Borth及其團隊在一系列實(shí)驗中研究了在亞克隆和克隆選擇用于生產(chǎn)細胞系生成過(guò)程中，異質(zhì)性是如何傳遞的。他們發(fā)現，亞克隆本身并沒(méi)有導致亞克隆與原始細胞池相比（無(wú)論是宿主細胞系還是重組細胞系）遺傳和表型異質(zhì)性的減少。相反，選擇特定的細胞特性導致了核型同質(zhì)性和染色體穩定性增加。Baik和Lee也研究了CHO細胞系不穩定性、核型變異和生產(chǎn)不穩定之間的聯(lián)系。他們提出了一個(gè)生產(chǎn)不穩定的機制模型，其中隨機的染色體重排與生長(cháng)優(yōu)勢和非生產(chǎn)或低生產(chǎn)克隆相關(guān)。同時(shí)，針對特定表型/基因型的MTX選擇降低了生長(cháng)速率，但提高了產(chǎn)品產(chǎn)量。在穩定重組細胞系的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，一個(gè)重要的問(wèn)題是生成和識別高產(chǎn)克隆，這些克隆不會(huì )隨時(shí)間失去表達能力。（克隆性在治療蛋白生產(chǎn)中被認為是關(guān)鍵的，因為克隆系被認為能提供穩定和一致的產(chǎn)品質(zhì)量特性。）然后需要在長(cháng)期培養中評估選定克隆的生產(chǎn)情況，這是一個(gè)勞動(dòng)密集型且耗時(shí)的過(guò)程。然而，目前在CHO細胞系上迅速積累的轉錄組數據為功能分析開(kāi)辟了道路，以識別高生產(chǎn)和克隆穩定性的調節因子和生物標志物。按照這種方法，Ritter及其同事分析了低產(chǎn)和高產(chǎn)CHO克隆的基因表達譜，以尋找細胞工程的潛在目標，使克隆選擇更快、更有效。他們發(fā)現，大多數穩定的高產(chǎn)克隆都標記為染色體8的端粒區域缺失。建立的實(shí)驗模型結果證實(shí)，與對照CHO-K1細胞相比，CHO-C8DEL細胞（染色體8的端粒區域缺失）表現出更高的體積生產(chǎn)率，并產(chǎn)生了更穩定的生產(chǎn)克隆。進(jìn)一步地，該團隊進(jìn)行了一系列敲除和敲低研究，并在選定的端粒區域內確定了兩個(gè)特定目標，Fam60A和C12orf35，它們在創(chuàng )造CHO-C8DEL細胞觀(guān)察到的表型中起作用。據報道，這些基因的缺失或表達減少與更高的生產(chǎn)率和更快地從選擇中恢復相關(guān)。

4.2.靶向基因組操作技術(shù)

在重組細胞系生成中，最密集的研究方向集中在使用靶向基因組整合技術(shù)進(jìn)行表達優(yōu)化。對于建立穩定和克?。ㄍ矗┥a(chǎn)者細胞系，轉基因需要整合到宿主基因組中。傳統方法依賴(lài)于表達載體的隨機整合，隨后從具有異質(zhì)轉基因插入的重組細胞池中耗時(shí)篩選合適的細胞。這種方法有兩個(gè)主要缺點(diǎn)：整合效率低和整合位點(diǎn)的位置效應。為克服這些問(wèn)題，人們做出了不同的嘗試。借助不同的轉座子系統（Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac、Tol2），成功提高了整合效率。據報道，使用轉座子介導的基因整合僅在2-3周內生成的重組CHO池能夠實(shí)現異常高的產(chǎn)品滴度（>7 g/L），因此可用于快速生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)。借助轉座子系統的基因整合仍然是一個(gè)感興趣領(lǐng)域，并正在評估其在生物醫學(xué)研究不同領(lǐng)域的潛在用途。過(guò)去十年中，幾個(gè)研究小組也解決了由于隨機整合導致的“位置效應”問(wèn)題。Neville等人綜述的普遍染色質(zhì)開(kāi)放元件（UCOEs）以及其他在高生產(chǎn)細胞基因組中識別的調控基序已被應用于防止基因沉默并維持高水平表達。細菌人工染色體（BACs）也是一種流行且廣泛使用的方法，用于確保整合轉基因的位點(diǎn)獨立、穩定和高水平表達（例如，在實(shí)驗室規模的生物反應器中為選定抗體達到0.75 g/L，在搖瓶中達到1.12 g/L）。

靶向基因組操作技術(shù)使得重組蛋白編碼基因能夠敲入到定義良好且轉錄活躍的基因組位點(diǎn)中。與隨機整合相比，這是一種建立生產(chǎn)克隆的更快且更高效的方法。靶向細胞基因組修飾得益于目標特異性基因編輯工具的出現，例如鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs）、成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）-CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9）RNA引導的核酸酶。其中，CRISPR/Cas9系統因其易用性（與ZFNs和TALENs相比）、高編輯效率和低成本而成為受歡迎的選擇?？删幊毯怂崦府a(chǎn)生雙鏈斷裂，這些斷裂在哺乳動(dòng)物細胞中通過(guò)內源性DNA修復機制解決。這些機制包括不同的途徑：i）非同源末端連接（NHEJ），ii）同源定向修復（HR）和iii）微同源介導的末端連接（MMEJ）。靶向基因組編輯工具的主要應用涉及在細胞或生物體的基因組中敲除或敲入感興趣的基因。
近年來(lái)，人們投入了大量努力來(lái)識別宿主細胞基因組中的轉錄“熱點(diǎn)”。靶位點(diǎn)的選擇基于先前的經(jīng)驗數據、轉錄組數據分析或借助慢病毒篩選。不同研究小組最近使用的位點(diǎn)包括Fer1L4、Rosa26、Hprt、Hipp11、C12orf35和GS。如今，最先進(jìn)的技術(shù)是整合不僅單個(gè)轉基因，還有復雜的盒式結構，稱(chēng)為“著(zhù)陸墊”，以生成主宿主細胞系。著(zhù)陸墊包含選擇標記和重組酶或整合酶的識別位點(diǎn)，允許精確插入任何種類(lèi)和任何數量的表達盒到已建立的位點(diǎn)。有許多系統已有效用于在哺乳動(dòng)物細胞中通過(guò)位點(diǎn)特異性重組介導表達盒交換，例如Cre-loxP、Flp-FRT、BxB1重組酶、PhiC31整合酶（見(jiàn)表1）。

最近的一項研究報道了多著(zhù)陸墊DNA整合平臺的開(kāi)發(fā)，該平臺在不同的基因組熱點(diǎn)插入了3-4個(gè)著(zhù)陸墊，用于先進(jìn)的細胞工程。其他小組生成了替代版本，允許累積整合相同基因的多個(gè)拷貝或不同基因。然而，這種構建可能會(huì )帶來(lái)重復介導的基因沉默問(wèn)題（也影響多順?lè )醋訕嫿ê捅舜私咏幕颍?，但有各種方法可用（例如使用表觀(guān)遺傳修飾元素，如絕緣子、UCOEs）來(lái)防止CHO細胞中轉基因的沉默。上述討論的平臺已開(kāi)發(fā)用于促進(jìn)制藥行業(yè)中重組生產(chǎn)細胞系的生成。它們也是表達優(yōu)化新型復雜蛋白治療藥物的有價(jià)值且有前景的工具，并且可能應用于合成生物學(xué)。

4.3.關(guān)于產(chǎn)品質(zhì)量和數量的難以表達的重組蛋白治療藥物的表達優(yōu)化

目前，大量經(jīng)過(guò)工程改造的復雜重組蛋白正在填充工業(yè)生產(chǎn)管線(xiàn)。盡管使用了先進(jìn)的CHO細胞表達平臺，這些蛋白在許多情況下被證明是“難以表達”的（DTE）。制藥行業(yè)的一個(gè)主要創(chuàng )新研究領(lǐng)域集中在提高這些生物產(chǎn)品的可制造性。最近，不同研究小組進(jìn)行了多次嘗試，試圖理解生產(chǎn)瓶頸的原因，并尋求這些問(wèn)題的解決方案。

首先需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是轉錄水平的表達優(yōu)化，這涉及表達構建設計、基因組整合方法以及與整合位點(diǎn)的基因組環(huán)境的相互作用。即使在定義良好的整合位點(diǎn)，重組蛋白的轉錄水平也受到整合位點(diǎn)與表達盒組件之間相互作用的影響。對這一現象的研究對于可編程細胞工程至關(guān)重要，以便能夠預測多個(gè)組件如何貢獻于插入轉基因的最終凈表達。為解決這一問(wèn)題，Kildegaard及其同事開(kāi)發(fā)了一個(gè)分子工具箱，用于系統評估產(chǎn)品和位點(diǎn)特異性重組基因表達。

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，他們構建了一系列具有針對著(zhù)陸墊的靶向整合位點(diǎn)的CHO-S模型細胞系，其中重組基因在定義的50近端調控元件下。他們表明，不同的調控元件在定義的整合位點(diǎn)產(chǎn)生了強大的重組基因表達模式，具有廣泛的轉錄輸出。Cartwright及其同事報道了開(kāi)發(fā)高通量微型平臺用于多并行測試不同遺傳組件，并系統評估它們對DTE蛋白生產(chǎn)的影響。該小組旨在優(yōu)化細胞工程解決方案，用于模型DTE IgG的穩定和瞬時(shí)生產(chǎn)。他們得出結論，最佳方法是產(chǎn)品和遺傳背景特異性的，并且穩定和瞬時(shí)生產(chǎn)之間存在顯著(zhù)差異。Tadauchi等人進(jìn)行了一項系統調查，旨在了解是什么使得抗體表達困難。他們構建了具有定義基因組整合位點(diǎn)的著(zhù)陸墊的模型細胞系，其中插入的轉基因在（Tet/Dox）誘導型啟動(dòng)子的控制下。該系統使得能夠表征可能具有毒性或因任何原因難以表達的蛋白的表達。其他工作集中在轉錄調控上，例如在miRNA介導（miR-557）的宿主細胞工程中，已被證明有助于增強DTE蛋白表達。

分泌缺陷是復雜治療藥物，特別是DTE單克隆抗體（如英夫利昔單抗）的另一個(gè)主要關(guān)注領(lǐng)域。針對這一問(wèn)題，不同研究團隊采用了多種方法。在最近的研究中，Hussein等人描述了一種新的蛋白質(zhì)工程策略，以繞過(guò)分泌瓶頸，從而提高DTE蛋白的生產(chǎn)。該團隊進(jìn)行了逐步分析，以了解限制選定重組蛋白TIMP-3和TIMP-4生產(chǎn)的分子機制，并確定翻譯后處理阻滯是蛋白表達的限制步驟。為克服這一限制，他們構建了一個(gè)融合蛋白，其中包含一個(gè)分泌生長(cháng)因子的短前序列，該序列具有蛋白酶furin的天然切割位點(diǎn)。同時(shí)，在同一實(shí)驗細胞系中過(guò)度表達furin。這種策略已成功用于提高原本分泌不佳的TIMP家族兩個(gè)成員的蛋白生產(chǎn)。在該研究之后，應用計算工具分析TIMP-3編碼核苷酸序列，以識別導致分泌不佳的序列特征。根據獲得的數據，該團隊構建了一個(gè)用于DTE重組靶標的蛋白質(zhì)嵌合體設計模型。Otte及其團隊報告了建立一種基于自動(dòng)化共聚焦顯微鏡的方法，用于研究細胞內DTE蛋白表達，以探索生產(chǎn)瓶頸的原因。在代表性研究中，Mathias等人追蹤了選定重組DTE蛋白在細胞合成過(guò)程中的處理，并調查了它們在分泌途徑相應細胞器中的分布。他們發(fā)現，在選定抗體的情況下，錯誤折疊是限制速率的步驟，也是阻礙分泌的原因，因為它導致了分子的內質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解。

除了體積生產(chǎn)率外，產(chǎn)品質(zhì)量對于生物治療蛋白生產(chǎn)也至關(guān)重要，并且一直是工業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)努力的焦點(diǎn)。糖蛋白是生物治療藥物中增長(cháng)最快的類(lèi)別。正確的翻譯后修飾，特別是糖鏈結構，對于這些生物制劑的效力以及藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性的控制至關(guān)重要。此外，不僅糖基化（唾液酸化、巖藻糖化）的性質(zhì)和數量重要，N-糖鏈的異質(zhì)性也可能是一個(gè)問(wèn)題。這種異質(zhì)性，由于N-糖鏈處理的變異性而產(chǎn)生，可能會(huì )損害糖治療藥物的活性和安全性。Yang及其同事描述了如何通過(guò)遺傳工程改造CHO細胞，以近乎均質(zhì)的形式生產(chǎn)糖蛋白。他們對CHO糖基轉移酶進(jìn)行了敲除篩選，以識別控制N-連接糖基化關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵基因，并表明CHO細胞能夠耐受糖工程改造而不會(huì )發(fā)生補償性變化。根據他們的結果，他們提供了一種在模型細胞系中重建更均質(zhì)糖基化能力的策略。

4.4.高通量篩選和選擇系統的最新進(jìn)展

選擇系統在幾十年間已經(jīng)標準化，然而，不同選擇系統的優(yōu)缺點(diǎn)仍然是一個(gè)爭論的話(huà)題，特別是在MTX選擇系統的情況下。幾項研究表明，由MTX選擇導致的基因擴增是重組細胞系生產(chǎn)不穩定性的一個(gè)主要原因。此外，多輪MTX選擇需要更長(cháng)的時(shí)間來(lái)生成細胞系。最近，Yeo等人也發(fā)表了一項大規模的比較研究，探討不同類(lèi)型的標記基因如何影響不同CHO細胞系的生產(chǎn)穩定性。他們的結果表明，需要針對不同類(lèi)型的CHO細胞優(yōu)化選擇標記基因的表達，以提高對最佳生產(chǎn)者克隆的選擇嚴格性。

隨著(zhù)市場(chǎng)對生物治療產(chǎn)品需求的增長(cháng)，時(shí)間和成本成為了制造過(guò)程中的重要因素。在過(guò)程設計和優(yōu)化中，更多地關(guān)注如何減少新生物產(chǎn)品重組細胞系生成所需的時(shí)間和成本。這推動(dòng)了高通量克隆篩選和表征的新方法和技術(shù)的發(fā)展。許多改進(jìn)工作集中在單克隆上，因為這是生產(chǎn)者細胞系建立過(guò)程中最耗時(shí)的環(huán)節?，F在已有幾種新技術(shù)可用于更有效地分離單細胞，取代傳統的“限制稀釋”方法?，F代克隆方法使用專(zhuān)門(mén)的儀器來(lái)確保單個(gè)細胞被播種到微量滴定板孔中。熒光激活細胞分選（FACS）已成功用于根據特定細胞屬性（表明高生產(chǎn)性）對單細胞進(jìn)行分選。Solentim開(kāi)發(fā)的VIPS（原位驗證板播種）以及Cytena單細胞打印機儀器結合了細胞播種與顯微鏡成像，以確保單細胞沉積，從而保證衍生克隆的單細胞起源。Berkeley Lights的Beacon平臺利用微流體和光電子定位技術(shù)，通過(guò)軟件控制操作，在單芯片上并行培養、操縱和表征數千個(gè)細胞。ClonePX FL提供了一種基于表達的方法，在半固體培養基上，用于高效高生產(chǎn)者克隆/菌落的選擇和分離。

許多這些技術(shù)發(fā)展和現代儀器為高通量自動(dòng)化過(guò)程提供了可能，已經(jīng)在制藥行業(yè)成功引入，并現在應用于工業(yè)重組蛋白生產(chǎn)。

4.5.“組學(xué)”技術(shù)——系統生物學(xué)方法

自2010年代以來(lái)，“組學(xué)”方法和“組學(xué)”技術(shù)的出現促進(jìn)了對細胞特征和身份特征的深入理解，這些特征表明了最佳生產(chǎn)狀態(tài)。在基因組學(xué)、轉錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)領(lǐng)域，現在有大量的數據（并且每天都在增加），這些數據提供了對特定時(shí)刻細胞狀態(tài)和特征的系統級洞察。Stolfa等人發(fā)表了關(guān)于CHO的可用資源和數據庫的全面總結。與此同時(shí)，生物信息學(xué)中計算方法和算法的不斷發(fā)展使得這些“組學(xué)”數據能夠被轉化為與細胞機制和功能相關(guān)的生物學(xué)信息。這些信息與計算建模一起被用于CHO研究的所有領(lǐng)域：用于預測細胞行為，探索重組細胞系中不同生產(chǎn)效率背后的轉錄組水平克隆變異，或識別操縱生產(chǎn)者細胞系應激反應和敏感性的新靶點(diǎn)。在最近的一項研究中，Kol等人進(jìn)行了多重分泌組分析，以研究宿主細胞蛋白對重組蛋白生產(chǎn)的影響。通過(guò)系統的計算機（計算篩選）和體外分析，Nguyen等人從CHO細胞中識別出內源性啟動(dòng)子和增強子元素，這些元素可用于轉基因表達優(yōu)化的潛在用途。Brown及其同事進(jìn)行了基于轉錄組的分析，以識別用于qPCR數據標準化的最佳參考CHO基因。該研究結果已適應于制藥行業(yè)常規用于生產(chǎn)者細胞系穩定性表征。隨著(zhù)“組學(xué)”技術(shù)的進(jìn)步，糖基化譜的系統分析為CHO細胞的糖基化網(wǎng)絡(luò )提供了新的見(jiàn)解，并有助于開(kāi)發(fā)新的糖工程策略，旨在產(chǎn)生更有效的療法，減少副作用——正如Tejwani等人在一篇全面的綜述中總結的那樣。Stach等人描述了一種將系統級動(dòng)力學(xué)模型與合成生物學(xué)相結合的方法，以研究N-糖基化的本質(zhì)，并測試遺傳擾動(dòng)對產(chǎn)生IgG的半乳糖化行為的協(xié)同作用。

5.未來(lái)展望

系統生物學(xué)方法為增強基于CHO的生物生產(chǎn)開(kāi)辟了新的維度。“組學(xué)”技術(shù)提供了更好地表征和理解復雜細胞功能的新機會(huì )，從而為機制驅動(dòng)的細胞系優(yōu)化創(chuàng )造了基礎，而不是操縱幾個(gè)關(guān)鍵基因。然而，一個(gè)主要問(wèn)題是這些現代技術(shù)需要特殊的儀器、材料和先進(jìn)的信息技術(shù)設施，因此它們仍然過(guò)于復雜和昂貴，無(wú)法在工業(yè)制造中常規使用。另一方面，迄今為止不同“組學(xué)”技術(shù)提供的數據還無(wú)法整合到一個(gè)通用的數學(xué)模型中，這將有助于在實(shí)驗過(guò)程設計中轉移和應用這些信息。如何將這些知識適應并整合到關(guān)于重組蛋白生產(chǎn)的工業(yè)生物過(guò)程優(yōu)化和開(kāi)發(fā)中仍然是一個(gè)挑戰，需要在未來(lái)解決。