利用 CRISPR-Cas 系統進(jìn)行基因組編輯，是治療遺傳疾病的有前景的途徑。2023年底，美國 FDA 批準了首 款CRISPR基因編輯療法上市，此外，還有許多基于 CRISPR 的基因編輯療法正在臨床試驗中，用于治療多種遺傳疾病，包括視網(wǎng)膜營(yíng)養不良、血友病、溶酶體貯積病以及某些類(lèi)型的癌癥。
然而，源自細菌的 Cas 核酸酶的細胞和體液免疫原性，很大程度上限制了 CRISPR 基因編輯療法的臨床應用。
2025年1月2日，張鋒團隊在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy 的研究論文。
該研究對用于 CRISPR 基因編輯治療的 Cas 核酸酶 SaCas9 和 AsCas12a 進(jìn)行了理性工程化改造，設計出了具有最小化免疫原性的 SaCas9 和 AsCas12a 突變體，在保持與野生型相當活性和特異性的情況下，顯著(zhù)降低了免疫原性。
這項研究為改造治療性蛋白以降低免疫原性提供了框架，并為開(kāi)發(fā)更安全的基于 CRISPR 的基因編輯療法奠定了基礎。
迄今為止，大多數基于 CRISPR 的基因編輯療法依賴(lài)于以下三種 Cas 核酸酶之一：化膿鏈球菌 Cas9 （SpCas9）、金黃色葡萄球菌 Cas9 （SaCas9）和氨基酸球菌 Cas12a （AsCas12a）。在這三者中，SaCas9 和 AsCas12a 是大多數體內治療策略的重點(diǎn)，因為它們的尺寸較小，可以被包裝到腺相關(guān)病毒（AAV）載體中，而 AAV 載體是體內基因治療的主要遞送方式。
除了有效遞送以外，CRISPR 基因編輯療法在體內應用的第二個(gè)挑戰在于其潛在的免疫原性，尤其是由于它們是細菌來(lái)源的，許多患者對微生物來(lái)源的分子已有預先存在的接觸和免疫反應。據報道，80% 的健康個(gè)體對金黃色葡萄球菌和化膿鏈球菌來(lái)源的蛋白質(zhì)具有體液免疫（由抗體介導）和細胞免疫（由T細胞介導）。
這種預先存在的免疫反應也適用于 Cas 核酸酶，對健康人類(lèi)捐贈者的血液分析顯示，78% 的人對 SaCas9 產(chǎn)生了類(lèi)別轉換的免疫球蛋白（IgG）抗體，58%的人對 SpCas9 有抗體，所有對 Cas9 細胞免疫呈陽(yáng)性反應的捐贈者也都有抗體活性，這表明適應性免疫和體液免疫之間存在高度一致性。
為了解決上述挑戰，研究團隊對 SaCas9 和 AsCas12a 進(jìn)行了分析，以確定假定的免疫原性表位，然后計算設計了預計可以逃逸免疫檢測的突變體。
預測與 MHC I 結合力降低的 SaCas9 和 AsCas12a 表位
然后，研究團隊通過(guò)實(shí)驗驗證了這些突變體，結果顯示，它們在體外消除了CD8+ T細胞的反應性，同時(shí)保持了天然水平的核酸酶活性和特異性。研究團隊進(jìn)一步證明，在具有免疫活性的MHC I/II 類(lèi)的人源化小鼠模型中，與野生型核酸酶相比，SaCas9 突變體有效地減少了體液免疫反應和細胞免疫反應。
具體來(lái)說(shuō)，該研究報道了兩種已在臨床使用的 SaCas9 和 AsCas12a 核酸酶的免疫原性降低的突變體，通過(guò) MHC 相關(guān)肽蛋白質(zhì)組學(xué)（MAPP）分析，確定了每個(gè)核酸酶上假定的免疫原性表位。利用計算模型進(jìn)行理性設計以逃避免疫反應。適應性免疫組分對 SaCas9 和 AsCas12a 的低免疫原性突變體（SaCas9.Redi 和 AsCas12a.Redi）的識別能力明顯較低，包括與 MHC 分子的結合親和力降低，以及產(chǎn)生細胞毒性 T 細胞應答的能力減弱，與此同時(shí)，這兩種突變體可保持與野生型相當活性和特異性。
在體內編輯實(shí)驗中，SaCas9.Redi.1對 PCSK9 基因的編輯與野生型 SaCas9 相當，但顯著(zhù)降低了不期望出現的免疫反應。證明了該方法在工程化設計蛋白以逃逸免疫檢測中的有效性。
這些結果為改造治療性蛋白以降低免疫原性提供了框架，并為開(kāi)發(fā)更安全的基于 CRISPR 的基因編輯療法奠定了基礎。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-55522-1
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