細胞中的亞細胞器通常具有精細的三維結構和生物學(xué)功能。利用熒光顯微鏡觀(guān)察細胞器的三維分布和動(dòng)態(tài)有助于了解細胞功能和揭示細胞器之間的相互作用。然而，熒光顯微鏡受到光學(xué)衍射極限和物鏡數值孔徑（NA）的限制，只能獲得模糊的低分辨率圖像。由于寬場(chǎng)顯微鏡和共聚焦顯微鏡的軸向分辨率（約500-700納米）顯著(zhù)低于其橫向分辨率（約200-300納米），因此在20世紀90年代，首先出現了提升軸向分辨率的成像技術(shù)：1992年，Stefan Hell開(kāi)發(fā)了基于點(diǎn)掃描共聚焦的4Pi顯微成像技術(shù)，利用兩個(gè)對置物鏡采集兩個(gè)逆向傳播的波前并使之發(fā)生干涉，壓縮了成像系統的點(diǎn)擴散函數（PSF），使軸向分辨率提升至寬場(chǎng)顯微鏡的5-7倍。1995年，Mats Gustafsson提出了基于寬場(chǎng)照明的圖像干涉成像技術(shù)I5M ，在對置物鏡的架構下，通過(guò)部分相干光形成駐波照明和熒光干涉寬場(chǎng)探測，同樣將軸向分辨率提升至寬場(chǎng)顯微鏡的5-7倍。

       進(jìn)入21世紀，研究人員陸續開(kāi)發(fā)了眾多突破光學(xué)衍射極限的超分辨成像技術(shù)，包括受激發(fā)射損耗成像技術(shù)（STED），單分子定位成像技術(shù)（SMLM）以及結構光照明成像技術(shù)（SIM）。將4Pi技術(shù)與這些超分辨技術(shù)相結合，誕生了一系列具備三維各向同性分辨率的超分辨顯微鏡系統。第一類(lèi)是與STED技術(shù)結合：2008年，Stefan Hell課題組提出了isoSTED，利用4Pi技術(shù)壓縮三維環(huán)狀損耗光斑的光強零點(diǎn)大小，實(shí)現50納米各向同性分辨率；2016年，Stefan Hell課題組采用可逆光開(kāi)關(guān)蛋白，開(kāi)發(fā)了可應用于活細胞的4Pi-RESOLFT；2021年，Joerg Bewersdorf課題組開(kāi)發(fā)了AO isoSTED，通過(guò)引入自適應光學(xué)技術(shù)，在組織樣品上實(shí)現了三維50納米分辨率。第二類(lèi)是與SMLM技術(shù)結合，利用4Pi技術(shù)采集熒光分子的自干涉圖樣，并根據干涉相位推斷單分子軸向位置。這包括Harald Hess課題組在2009年開(kāi)發(fā)的iPALM，Alexander Egner課題組在2011年開(kāi)發(fā)的4Pi-SMS，以及Joerg Bewersdorf課題組在2016年開(kāi)發(fā)的W-4PiSMSN和2020年開(kāi)發(fā)的多色4Pi-SMS。第三類(lèi)通過(guò)將4Pi與3D-SIM相結合，引入六束照明光干涉和熒光干涉。2008年，Mats Gustafsson課題組的邵林博士開(kāi)發(fā)了非相干結構光照明圖像干涉顯微術(shù)I5S，在固定細胞上實(shí)現了三維100納米各向同性分辨率。

       然而，在上述三維各向同性分辨率的超分辨成像系統中，isoSTED、iPALM和4Pi-SMS僅適用于固定細胞；4Pi-RESOLFT雖然可以用于活細胞，但成像速度慢，只能采集少數幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)用價(jià)值較低；I5S具有活細胞成像的潛力，但系統復雜且不穩定，多年來(lái)缺乏硬件和算法的改進(jìn)，暫無(wú)生物學(xué)應用場(chǎng)景。因此，在活細胞上實(shí)現三維各向同性分辨率的快速超分辨成像，仍然是細胞生物學(xué)領(lǐng)域長(cháng)期夢(mèng)寐以求的目標。

       2024年12月23日，西湖大學(xué)章永登團隊與北京大學(xué)黃小帥團隊、重慶郵電大學(xué)范駿超團隊、北京大學(xué)陳良怡團隊合作，在 Nature Methods 期刊發(fā)表了題為：Elucidating subcellular architecture and dynamics at isotropic 100 nm resolution with 4Pi-SIM 的研究論文。

       該研究提出了一種新型4Pi-SIM超分辨顯微鏡架構，以三維各向同性100 納米分辨率揭示了不同類(lèi)型細胞中復雜精細的亞細胞結構。4Pi-SIM首次在活細胞上實(shí)現了三維各向同性100納米光學(xué)分辨率延時(shí)成像，成像時(shí)程可達數小時(shí)（500-600個(gè)時(shí)間點(diǎn)）。此外，4Pi-SIM還具備同時(shí)雙色成像能力，能夠捕捉三維空間內不同細胞器之間的快速相互作用過(guò)程。

       研究團隊基于4Pi單分子超分辨顯微鏡[11]和海森結構光照明顯微鏡的研究經(jīng)驗，對4Pi-SIM顯微鏡的光學(xué)結構和機械結構進(jìn)行了精心設計（圖1），最大 程度地降低了熱波動(dòng)和機械振動(dòng)的影響，確保了六束光干涉對齊和熒光干涉的長(cháng)期穩定性；通過(guò)引入鎖焦模塊，系統能夠保證兩個(gè)物鏡精確對齊；通過(guò)設計光程差調節模塊，系統能夠快速、精確地將上下干涉臂的光程差微調至零；此外，系統采用新穎的I2M照明模塊，并改進(jìn)了重建算法，自適應地估計和補償原始數據中系統光程差不匹配導致的相位誤差，從而最大限度地減少長(cháng)時(shí)程成像時(shí)的重建偽影。

圖1：4Pi-SIM超分辨顯微鏡的原理圖和系統設計圖。a，4Pi-SIM系統原理圖。b，4Pi-SIM系統設計圖。

       上述改進(jìn)使4Pi-SIM能夠在三維空間內以極 佳的清晰度和細節捕捉觀(guān)察各種亞細胞結構。例如，研究團隊利用4Pi-SIM成功展示了小鼠精母細胞中聯(lián)會(huì )復合體的雙螺旋結構。而3D-SIM由于軸向分辨率不足，在軸向視野中錯誤地合并了兩條染色體結構（圖2a-c）。此外，研究團隊還利用4Pi-SIM觀(guān)察了固定HeLa細胞的細胞膜結構。細胞膜通常在表面形成許多直徑為100-300納米的絲狀偽足。4Pi-SIM可以清晰地分辨出這些絲狀偽足在橫向和軸向的中空結構。相比之下，3D-SIM的軸向視圖中無(wú)法分辨絲狀偽足的細節特征（圖2d-e）。

圖2：4Pi-SIM用于固定細胞三維超分辨成像。a-c，小鼠精母細胞免疫熒光標記聯(lián)會(huì )復合體的4Pi-SIM成像。d-e，HeLa細胞免疫熒光標記細胞質(zhì)膜的4Pi-SIM成像。

       長(cháng)時(shí)程成像實(shí)驗需要保證4Pi-SIM中干涉腔的長(cháng)期穩定性，并在重建算法中對成像過(guò)程中系統光程差的漂移進(jìn)行補償。因此，活細胞成像相對于固定細胞而言更加具有挑戰性。研究團隊利用4Pi-SIM對標記線(xiàn)粒體外膜的HeLa細胞進(jìn)行延時(shí)成像，重建圖像展現出清晰的中空結構，并捕捉到了線(xiàn)粒體的動(dòng)態(tài)行為（圖3a-b）。在一個(gè)區域，研究團隊觀(guān)察到棒狀線(xiàn)粒體轉變?yōu)轭?lèi)似凹盤(pán)的結構（圖3c）；在另一個(gè)區域，則觀(guān)察到管狀線(xiàn)粒體從兩端生成納米管道，其直徑從約600納米減小到150納米（圖3d）。

       內質(zhì)網(wǎng)具有錯綜復雜的三維網(wǎng)絡(luò )結構，并在活細胞內表現出顯著(zhù)的動(dòng)態(tài)特性。借助4Pi-SIM的超高時(shí)空分辨率，研究團隊在COS-7細胞中觀(guān)察到內質(zhì)網(wǎng)的快速重組，并捕捉到管狀內質(zhì)網(wǎng)逐漸形成片狀內質(zhì)網(wǎng)的過(guò)程（圖3e-g）。

圖3：4Pi-SIM用于活細胞快速三維超分辨成像。a-d，HeLa細胞中線(xiàn)粒體的4Pi-SIM動(dòng)態(tài)成像。e-g，COS-7細胞中內質(zhì)網(wǎng)的4Pi-SIM動(dòng)態(tài)成像。

       多色成像對于研究三維空間中相鄰細胞器之間的動(dòng)態(tài)相互作用至關(guān)重要。研究團隊使用光穩定性好的綠色熒光蛋白StayGold和一種大斯托克斯位移的熒光蛋白（dCyOFP2s）標記樣本，在單色激發(fā)波長(cháng)下實(shí)現了同時(shí)采集雙色熒光信號的活細胞成像。通過(guò)在活細胞中同時(shí)標記內質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體，研究團隊觀(guān)察了內質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體的相互作用（圖4a-b），并捕捉到線(xiàn)粒體在兩個(gè)細胞器的接觸點(diǎn)發(fā)生了融合和分裂事件（圖4c-d）。此外，研究團隊在活細胞中同時(shí)標記內質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體，觀(guān)察到內質(zhì)網(wǎng)管狀網(wǎng)絡(luò )和微管錯綜復雜地交織在一起，形成了橫跨細胞質(zhì)的動(dòng)態(tài)互連（圖4e-f）。這些快速的相互作用促進(jìn)了兩種細胞器的重新排列（圖4g-h）。

圖4：4Pi-SIM同時(shí)雙色成像。a-d，HeLa細胞中內質(zhì)網(wǎng)（品紅色）和線(xiàn)粒體（綠色）的雙色4Pi-SIM動(dòng)態(tài)成像。e-h，COS-7細胞中內質(zhì)網(wǎng)（品紅色）和微管（綠色）的雙色4Pi-SIM動(dòng)態(tài)成像。

       4Pi-SIM 顯微鏡代表了活細胞三維超分辨顯微成像領(lǐng)域的重要進(jìn)展。自2008年Mats Gustafsson課題組的邵林博士開(kāi)發(fā)I5S以來(lái)，改進(jìn)后的4Pi-SIM首次實(shí)現了在活細胞上以三維各向同性100納米分辨率進(jìn)行數百個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高質(zhì)量延時(shí)成像。正如Marcel Proust所言: "The real voyage of discovery consists not in seeking new landscapes, but in having new eyes." 4Pi-SIM顯微鏡在闡明納米尺度的亞細胞精細結構和動(dòng)態(tài)行為等方面具有重要潛力，有望為細胞生物學(xué)的發(fā)展提供新的觀(guān)察視角和研究思路。

       論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02515-z