PART.

       01

       背景介紹

       人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是由肝實(shí)質(zhì)細胞合成并釋放到血液中的一種蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白40%-60%。因為具有良好的血清穩定性和半衰期，擁有多個(gè)配體結合位點(diǎn)、可逆結合藥物等特點(diǎn)，因此HSA一直被認為是一種天然藥物載體蛋白，可以延長(cháng)血漿中藥物半衰期[1]。例如，HSA與胰島素類(lèi)似物L(fēng)evemir®，胰高血糖素樣1型（GLP-1）激動(dòng)劑Victoza®等藥物的可逆結合，有效延長(cháng)了這些藥物對糖尿病的治療效果[2]。同時(shí)作為一種替代策略，長(cháng)效藥物納米顆粒白蛋白結合紫杉醇（Abraxane®）也已被批準用于癌癥臨床治療[3]；利用與HSA基因融合方法， GLP-1受體激動(dòng)劑Albiglutide已被批準在包括歐盟和美國在內的多個(gè)地區治療II型糖尿病[4]。自然狀態(tài)下藥物與白蛋白的結合效率并不高。藥物通過(guò)抗體與白蛋白的非共價(jià)結合，或通過(guò)基因結構域融合等方法在一定程度上延長(cháng)了藥物在體內的半衰期、增加了藥物負載和療效（圖1A）。

       FcRn（neonatal Fc receptor）是位于細胞膜表面的IgG受體，最初被發(fā)現參與新生兒通過(guò)胎盤(pán)從母體獲得被動(dòng)免疫。FcRn的蛋白結構與MHC-I 分子類(lèi)似，是由α鏈和β2微球蛋白非共價(jià)結合組成的異二聚體，在體內多種組織上皮細胞、內皮細胞及多種免疫細胞中廣泛表達[5]。FcRn可與IgG抗體的Fc結構域結合，可阻止IgG分子被溶酶體降解。其內在機制為FcRn與IgG的結合具有pH依賴(lài)性。血管內皮細胞通過(guò)內吞作用，將血清中的IgG攝入細胞內，IgG與FcRn在酸化的內體（endosome，pH6.0-6.5）中高效結合，并跟隨FcRn轉運至細胞膜表面。在中性（pH7.0-7.5）或微堿性（pH7.35-7.45）的細胞外血液中，IgG與FcRn發(fā)生解離，重新被釋放回血液循環(huán)中，因此FcRn與IgG在不同pH環(huán)境下的結合與解離能力可影響血清中IgG抗體的半衰期[6]。通過(guò)對抗體Fc結構域進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變，可以改善IgG分子在體內的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效特性。但是過(guò)度延長(cháng)IgG藥物的半衰期也容易通過(guò)補體、FcR等途徑過(guò)度激活人的天然免疫系統，導致臨床效果并不理想。另外過(guò)多的突變位點(diǎn)也可影響抗體Fc結構域的穩定性及免疫原性。

       白蛋白介導的藥物半衰期在某種程度上依賴(lài)于與內源性FcRn的相互作用。研究顯示，FcRn同樣可結合白蛋白。在平衡條件下，FcRn與IgG以2:1的比例結合，白蛋白的其他位點(diǎn)與FcRn以1:1的比例結合，FcRn對白蛋白的內在保護機制與IgG 類(lèi)似，同樣以pH依賴(lài)的方式將白蛋白釋放回血液中參與體內循環(huán)（圖1 B C），而且這種結合本質(zhì)上是疏水的[7]。FcRn的存在極大延長(cháng)了白蛋白在血漿中的半衰期[1]。通過(guò)調節FcRn與白蛋白的條件性結合已經(jīng)逐漸成為一種極具吸引力的藥物傳遞技術(shù)。多種藥物通過(guò)直接與Fc/HSA進(jìn)行融合或耦聯(lián)、或通過(guò)改造Fc/HSA與FcRn的結合力度，在一定程度上延長(cháng)了藥物在血清中的半衰期和藥效[8]。但是通過(guò)小鼠模型來(lái)研究發(fā)現，HAS和MSA（小鼠血漿白蛋白）跟鼠FcRn存在競爭性結合，導致HSA與鼠FcRn之間的相互作用很弱，HSA的半衰期并未得到有效改善[9]。因為單人源化HSA的小鼠模型并不利于臨床前研究。所以雙人源化的FcRn與Albumin嚙齒動(dòng)物模型對于模擬人體生理狀態(tài)藥物代謝及長(cháng)效藥物開(kāi)發(fā)顯得尤為重要。

       圖1. 血清白蛋白依賴(lài)的長(cháng)效藥物機理

       PART.

       02

       FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型

       與白蛋白相關(guān)長(cháng)效抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)

       為了支持血清白蛋白（HSA）介導的長(cháng)效藥物研發(fā)，未來(lái)模式已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)了FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型。該模型的設計旨在模擬HSA與FcRn在人體內的表達和代謝模式，為藥物研發(fā)提供了重要的實(shí)驗平臺。具體來(lái)說(shuō)，圖2展示了FcRn基因人源化策略和表達驗證結果。Western雜交實(shí)驗結果表明，人FcRn在肝臟組織中得到了穩定的表達，而在野生型小鼠中沒(méi)有檢測到人FcRn的表達。同時(shí)，圖3還展示了Albumin基因人源化策略和表達驗證結果，Elisa實(shí)驗結果表明，在小鼠血清中，HAS表現出接近生理水平的表達。

       圖2. FcRn基因的人源化及其在肝臟的表達

       圖3. Albumin基因人源化及其在小鼠血清的表達

       這一雙人源化小鼠模型在白蛋白相關(guān)長(cháng)效抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)中具有重要意義。在藥物研發(fā)中，一種常見(jiàn)的策略是使用雙特異抗體分子，這些分子可以特異性地結合兩個(gè)不同的抗原分子。尤其對于靶向CD3T細胞和腫瘤細胞的雙特異抗體分子，由于其容易引發(fā)Fc介導的細胞毒性，研究人員開(kāi)始探索不包含Fc部分的CD3雙特異抗體分子[10]。IMB45400是某公司開(kāi)發(fā)的無(wú)Fc端雙特異抗體分子。然而，該分子在體內半衰期較短。為了解決這一問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了可以共價(jià)結合HSA的CD3雙特異抗體分子(IMB454001)。在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體內，IMB454001的半衰期比IMB45400提高了11倍。這種結合了HSA的雙特異分子提高了藥物的安全性，同時(shí)改善了其體內藥理動(dòng)力學(xué)表現，如圖4所示。

       圖4. 通過(guò)與HSA結合提高CD3雙特異抗體藥物在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體體內藥物動(dòng)力學(xué)

       類(lèi)似的設計策略也可以應用于其他重組蛋白藥物，例如，納米抗體和細胞因子的分子量比較小，其自身可以被工程化以改善其藥代動(dòng)力學(xué)。通過(guò)與HSA的融合或者增強與HAS的親和有助于提高這些分子的穩定性，降低在體內的降解速率，從而延長(cháng)它們的半衰期，提高藥物效果。與Fc融合蛋白相比，HSA結合蛋白藥物在提高藥物安全性方面具有優(yōu)勢，因為Fc部分可能引發(fā)不需要的免疫反應。同時(shí)，HSA還可以用于將多個(gè)藥物或分子結合到一個(gè)載體中，實(shí)現多功能性藥物特性，從而增強治療效果。

       在細胞基因治療（CGT）方向，許多藥物也可以通過(guò)與HSA的結合來(lái)延長(cháng)其半衰期。外泌體（extracellular vesicles，EVs）是一類(lèi)細胞分泌的小型膜囊泡，包含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和其他生物分子，對細胞間通信、疾病傳播和免疫調節等方面發(fā)揮重要作用。例如，某些公司通過(guò)基因改造外泌體，使其具有高度親和HSA的特性，從而顯著(zhù)延長(cháng)其在體內的藥物動(dòng)力學(xué)，增加了藥效，如圖5所示。這種策略有助于改善外泌體作為一種藥物輸送工具的性能，增加了外泌體在藥物輸送中的應用前景。

       圖5. 基因工程改造的外泌體及其在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體內的藥代研究

       此外，HSA還可以應用于小核酸藥物的研發(fā)，這類(lèi)藥物包括siRNA（小干擾RNA）和miRNA（微小RNA）。它們在肝臟疾病治療中廣泛應用，尤其是在遺傳性肝病和病毒感染方面。然而，siRNA的藥物動(dòng)力學(xué)需要改進(jìn)，以確保它們能夠準確地作用于目標細胞而不被迅速代謝和排泄。例如，通過(guò)適配體(aptamer)可以增加HAS和小核酸藥物之間的親和力，從而增強HSA對siRNA的保護作用，如圖6[11]。這個(gè)領(lǐng)域的研究和開(kāi)發(fā)是不斷發(fā)展前進(jìn)的，已經(jīng)有一些創(chuàng )新藥物問(wèn)世。Inclisiran是一種用于控制膽固醇水平的siRNA藥物，被設計為通過(guò)HSA在體內輸送，以減少LDL膽固醇水平。Miravirsen是一種miRNA抗體藥物，用于治療丙型肝炎病毒（HCV）感染，它被設計為與HSA結合，提高了藥物的穩定性并延長(cháng)在體內的生命周期。Nusinersen是用于治療脊髓肌肉萎縮癥的藥物，是一種修飾的小干擾RNA，與HSA結合以延長(cháng)在體內的藥物效應。

       圖6. 通過(guò)適配體(aptamer)可以增加ssRNA的藥物動(dòng)力學(xué)

       這些藥物的應用領(lǐng)域各不相同，但它們共同利用了HSA的長(cháng)效性質(zhì)，以提高藥物的療效和/或降低副作用。此外，該領(lǐng)域仍在不斷發(fā)展，可能還有其他HSA相關(guān)的長(cháng)效藥物在臨床中開(kāi)發(fā)。

       為了便于研究這些藥物在人免疫系統和腫瘤相互作用中的藥效，未來(lái)模式還將雙人源化小鼠與免疫缺陷小鼠NV-NSG進(jìn)行交配。這一交配策略的目的是創(chuàng )建具有免疫缺陷但同時(shí)具備HSA介導的長(cháng)效藥物代謝的小鼠模型，以更準確地模擬藥物在人體內的表現。通過(guò)將雙人源化小鼠與NV-NSG小鼠進(jìn)行交叉，研究人員可以獲得同時(shí)具備FcRn/Albumin雙人源化和免疫缺陷特征的模型。這種模型使研究人員能夠更好地理解藥物在免疫受體上的相互作用，以及其在人源免疫環(huán)境中的藥效。這對于抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)和評估具有重要意義，因為藥物在免疫系統和腫瘤細胞之間的相互作用對其療效產(chǎn)生重要影響。

       總之，HSA及FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型在白蛋白相關(guān)長(cháng)效抗腫瘤藥物以及小核酸藥物的研發(fā)中具有關(guān)鍵作用。這一模型提供了寶貴的工具，可用于研究和優(yōu)化不同類(lèi)型的長(cháng)效藥物，從而有望提高藥物的療效，延長(cháng)藥物在體內的生命周期，并增加治療的成功率。