嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T細胞治療在血液惡性腫瘤取得了巨大的成就。2017年，美國食品藥物監督管理局（FDA）首次批準了兩種CAR-T療法，即tisagenlecleucel（Kymriah®）和Axicabatagene ciloleucel（Yescarta®），分別用于治療急性淋巴細胞白血病和彌漫性大B細胞淋巴瘤。到目前為止，已有5種CAR-T療法得到了批準。CAR-T細胞療法作為癌癥治療方面革命性的生物技術(shù)產(chǎn)品，展現出未來(lái)征服癌癥的卓越潛力。

       然而CAR-T細胞仍存在一些不足，例如副作用、毒性、T細胞耗竭，并且在實(shí)體瘤的治療中顯示出很低的療效等。目前，以CAR技術(shù)為核心的新型細胞療法，CAR-NK、CAR-NKT、CAR-巨噬細胞（CAR-M）、CAR-Treg、CAR-γδT等異軍突起，尤其CAR-NK和CAR-M在腫瘤的免疫治療中展現出廣闊的前景。

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       CAR-T細胞發(fā)展簡(jiǎn)史

       回顧CAR-T的發(fā)展史，首先要提到1957年Thomas及其同事報告的首次白血病患者骨髓移植以及隨后Miller等人發(fā)現了T細胞的起源。然而，直到1986年Steven Rosenberg報告了一項關(guān)于腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的研究，這才讓人們將目光鎖定在“患者自身的免疫細胞可以對抗自身癌癥”的理念上。

       1992年，Sadelain等人成功地建立了逆轉錄病毒介導的基因轉移到T淋巴細胞的方法，使基因修飾成為在實(shí)驗或治療環(huán)境中控制免疫的手段。幾乎與此同時(shí)，ZeligEshhar及其同事利用抗體結合域和T細胞受體上免疫球蛋白的γ或ζ亞單位，通過(guò)嵌合單鏈設計了細胞毒性淋巴細胞的特異性激活，從而開(kāi)發(fā)出第一代CAR-T細胞。

       五年后，Sadelain博士的研究小組證明，將CD28等共刺激信號整合到CAR-T中可增強生存、增殖并保持活性，從而開(kāi)發(fā)出第二代CAR。隨后，攜帶靶向CD19的CAR-T細胞被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并啟動(dòng)了慢性淋巴細胞白血?。–LL）和急性淋巴細胞白血?。ˋLL）的I期臨床試驗。試驗結果證明CAR-T療法在化療難治性ALL的成人中誘導有效緩解，隨后生物工藝生產(chǎn)規模擴大。

       2017年，FDA批準了CD19 CAR-T細胞療法（Tisagenlecleucel）適用于兒童和年輕人的ALL。到目前為止，FDA批準了五種用于癌癥治療的CAR-T細胞治療藥物。

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       CAR-T細胞治療的挑戰

       CAR-T細胞治療面臨的挑戰，主要與副作用、毒性、T細胞耗竭和惡性腫瘤微環(huán)境（TME）有關(guān)。此外，在大規模生產(chǎn)中的制造過(guò)程目前既耗時(shí)又昂貴，因此，使盡可能多的患者接受CAR-T細胞免疫治療成為一個(gè)更大的挑戰。

       1.副作用和毒性

       在CAR-T細胞輸注后，這種免疫療法可能具有潛在的致命毒性。毒性主要有兩類(lèi)：細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性（NTX）或CAR-T細胞相關(guān)腦病綜合征（CRES）。

       CRS或“細胞因子風(fēng)暴”是一種全身炎癥反應，由大量活化淋巴細胞（B細胞、T細胞和自然殺傷細胞）以及髓系細胞（巨噬細胞、樹(shù)突狀細胞和單核細胞）引起廣泛的臨床癥狀，包括發(fā)熱、疲勞、頭痛、皮疹、關(guān)節痛和肌痛。NTX是CAR-T細胞免疫治療的另一常見(jiàn)并發(fā)癥，發(fā)生在40%以上的患者中?；颊弑憩F出各種癥狀，如困惑、遲鈍、震顫、譫妄、找詞困難和頭痛。

       2.CAR-T細胞耗竭

       盡管CAR-T細胞治療完全緩解率高，然而大部分獲得緩解的患者在幾年內表現出疾病復發(fā)，B-ALL的復發(fā)率從21%到45%不等，并隨著(zhù)隨訪(fǎng)時(shí)間的延長(cháng)而增加。治療失敗的部分原因是實(shí)體瘤產(chǎn)生的TME導致的CAR-T細胞耗竭。

       CAR-T細胞耗竭是指一種功能障礙狀態(tài)，其特征是由于持續的抗原刺激、CAR結構的共刺激域和抑制性受體的表達增加而導致抗原特異性T細胞的缺失。體外CAR-T細胞研究表明，在CAR-T細胞耗竭過(guò)程中，抑制性受體（如PD-1、Lag3、Tim3和TIGIT）的表達上調，以及通過(guò)CTLA-4抑制PI3K/AKT通路，是導致抗腫瘤功能喪失的主要原因。細胞因子在其中也起著(zhù)重要作用，如耗竭的CAR-T細胞降低表達分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的能力此外。其他因素，如轉錄因子、代謝和表觀(guān)遺傳修飾，也在CAR-T細胞耗竭發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

       3.腫瘤微環(huán)境

       CAR T細胞免疫治療在實(shí)體瘤中尚未取得成功。一個(gè)可能的原因是TME的免疫抑制性質(zhì)影響過(guò)繼免疫治療的療效。實(shí)體瘤存在高度浸潤間質(zhì)細胞，如癌相關(guān)成纖維細胞（CAF）和抑制性免疫細胞，包括髓源性抑制細胞（MDSCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）、腫瘤相關(guān)中性粒細胞（TAN）、肥大細胞，和調節性T細胞（Treg），它們有助于建立一種免疫抑制性TME，能夠干擾CAR-T細胞療法的療效。

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       CAR-NK的研究概況

       NK細胞是第一個(gè)被鑒定的先天性淋巴細胞（ILC）亞型，能對病毒感染和/或轉化的細胞產(chǎn)生多種效應器功能，主要是細胞殺傷和產(chǎn)生促炎細胞因子。CAR-NK療法的研究目前處于起步階段，臨床前和臨床研究的數量逐年增加，這體現在每年都在增加的關(guān)于CAR-NK的研究論文。

       此外，在研究的靶標方面，Her2是實(shí)體瘤最常用的靶點(diǎn)，而CD19抗原在血液腫瘤中最常見(jiàn)。使用原代NK細胞的研究中，65%的人在研究B細胞惡性腫瘤，CD19是最受 歡迎的靶點(diǎn)。有趣的是，在使用NK細胞系的研究中，研究實(shí)體瘤是血液惡性腫瘤的2倍以上。

       在臨床研究方面， CD19-CAR-NK細胞對血液系統腫瘤有很高的應答率。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK細胞臨床研究也針對CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對血液惡性腫瘤的CAR-NK細胞臨床試驗正在進(jìn)行中。

       還有多項針對實(shí)體瘤的研究處于啟動(dòng)或招募階段。

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       CAR-NK的優(yōu)勢與挑戰

       CAR-NK細胞和CAR-T細胞一樣存在胞外、跨膜和胞內信號傳導域。NK細胞通過(guò)另外兩個(gè)共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其細胞毒性能力和細胞因子的產(chǎn)生。因此，比CAR-T細胞具有更強的腫瘤特異性靶向性和細胞毒性。CAR-NK細胞療法可能在未來(lái)成為CAR-T療法的替代方案，因為CAR-NK細胞具有以下超越CAR-T的幾個(gè)獨特特征。

       首先，異基因NK細胞對于過(guò)繼性細胞治療（ACT）是相當安全的，因為它們通常不介導發(fā)生GVHD。此外，NK細胞僅分泌少量IFN-γ和GM-CSF，不產(chǎn)生啟動(dòng)CRS的IL-1和IL-6。其次，除了通過(guò)單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來(lái)抑制癌細胞外，NK細胞還可以通過(guò)多種受體識別各種配體來(lái)抑制癌細胞，例如自然細胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。最后，NK細胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類(lèi)胚胎干細胞（HESC）、誘導多能干細胞（IPSC）甚至NK-92細胞系中產(chǎn)生。

       與此同時(shí)，CAR-NK也面臨著(zhù)一些挑戰。首先，在缺乏細胞因子支持的情況下，輸注細胞缺乏體內持久性是過(guò)繼NK細胞治療的主要缺點(diǎn)之一。雖然它可能更安全的，但它也會(huì )限制NK細胞免疫治療的效果。其次，快速歸巢到腫瘤床對于過(guò)繼性細胞治療效果至關(guān)重要，并且受NK細胞和腫瘤細胞釋放的趨化因子之間復雜相互作用的控制。然而，NK細胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭議，因此促使人們不斷努力去進(jìn)行改進(jìn)。第三，同CAR-T類(lèi)似，TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細胞和妨礙免疫細胞功能的不利環(huán)境，是CAR-NK細胞治療的主要障礙。最后，基于慢病毒的轉導系統是細胞內基因修飾和傳遞的最常用的方法之一。然而，由于自然特性，NK細胞對慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉導成為一個(gè)挑戰。

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       CAR-M的研究進(jìn)展

       鑒于CAR-T細胞治療的成功和CAR-NK細胞的發(fā)展潛力，研究人員對開(kāi)發(fā)用于腫瘤免疫治療的CAR巨噬細胞（CAR-M）產(chǎn)生了極大的興趣。CAR-M的出現為治療實(shí)體瘤開(kāi)辟了新的可能性：用特異性CARs修飾人巨噬細胞，以提高巨噬細胞對腫瘤的吞噬活性和抗原呈遞。

       目前使用CAR-M治療癌癥已進(jìn)行了多種嘗試。研究人員設計了嵌合抗原受體吞噬細胞（CAR-P），它可以引導巨噬細胞吞噬特定的靶細胞。

       研究證明，表達Megf10或FcRv胞內結構域的CAR-P可促進(jìn)對靶抗原的吞噬能力。CAR-PMegf10可以特異性地觸發(fā)對靶向配體的吞噬作用，通過(guò)酪氨酸磷酸化的局部信號級聯(lián)反應啟動(dòng)吞噬，TCR-CD3ζ可能通過(guò)招募syk激酶而促進(jìn)CAR-P的吞噬作用。

       全細胞吞噬是比較罕見(jiàn)的，而啃咬靶細胞更為頻繁，這表明CAR-P巨噬細胞與靶細胞之間的相互作用不足以觸發(fā)直接的全細胞吞噬。已有研究發(fā)現，PI3K信號在大靶點(diǎn)的內吞過(guò)程中起重要作用，可以促進(jìn)巨噬細胞的吞噬作用。研究人員將pI3K p85亞單位與CAR-P-FcRv連接起來(lái)，形成一個(gè)“串聯(lián)”CAR（CAR-Ptandem）。CAR-Ptandem具有較好的全細胞吞噬功能。

       賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員使用含有CD3-ζ胞內結構域的抗HER2的CAR-M。在兩種實(shí)體瘤移植的異位小鼠模型中，單次注射抗HER2-CAR-M可降低腫瘤負荷，延長(cháng)小鼠存活時(shí)間。在人源化小鼠模型中還發(fā)現， HER2-CAR-M能夠將M2巨噬細胞轉化為M1巨噬細胞，誘導炎癥性腫瘤微環(huán)境，增強T細胞的抗腫瘤細胞毒性。此外，還發(fā)現HER2-CAR-M可能產(chǎn)生表位擴散，為避免腫瘤免疫逃逸提供了新思路。

       Zhang等人利用誘導多能干細胞（iPSCs）表達CAR結構并分化為巨噬細胞，命名為CAR-iMac。研究表明，表達CAR的iPSCs能分化為巨噬細胞樣細胞，在無(wú)抗原的情況下，CAR-iMac更接近M2極化狀態(tài)。然而，在存在特異性抗原的情況下如CD19，CAR介導的信號促進(jìn)了CAR-iMac的吞噬作用，并導致CAR-iMac向促炎的M1型的轉化。iPSC來(lái)源的巨噬細胞可能成為髓系腫瘤免疫治療的重要細胞來(lái)源。

       CAR-T治療實(shí)體瘤無(wú)效的一個(gè)重要原因是T細胞難以進(jìn)入腫瘤組織。這是因為實(shí)體瘤細胞外基質(zhì)（ECM）形成的物理屏障阻止了T細胞進(jìn)入腫瘤組織。ECM由高度有序的纖維分子、糖蛋白和其他大分子產(chǎn)生，其合成和降解主要受基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）的調控，而巨噬細胞就是MMP的重要來(lái)源。

       研究人員設計了一種CAR-147的結構，它由靶向人HER2的單鏈抗體、IghG1的鉸鏈區和小鼠CD147分子的跨膜和細胞內區域組成。CAR-147與HER2+人乳腺癌細胞共培養后，在CAR-147巨噬細胞中誘導多個(gè)MMP的表達，證明CAR-147能特異性識別HER2抗原，有效激活巨噬細胞中MMP的表達。CAR-147巨噬細胞在體外不抑制腫瘤細胞增殖，但靜脈注射CAR-147巨噬細胞可顯著(zhù)抑制4T1乳腺癌小鼠模型的腫瘤生長(cháng)。同時(shí)發(fā)現用CAR-147巨噬細胞治療的腫瘤中T細胞所占的比例遠高于對照巨噬細胞治療的腫瘤，說(shuō)明CAR-147巨噬細胞能破壞腫瘤細胞外基質(zhì)，促進(jìn)T細胞向腫瘤浸潤。

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       CAR-M治療實(shí)體瘤的臨床應用

       直到2020年11月，兩個(gè)基于CAR-M策略的臨床試驗已經(jīng)獲得FDA的批準。第一個(gè)是來(lái)自CARISMA Therapeutics的候選藥物CT-0508，它用抗HER2的CAR-M治療復發(fā)/難治性HER2過(guò)度表達的腫瘤患者（I期臨床試驗）。另一個(gè)是Maxyte的MCY-M11，它利用mRNA轉染PBMC表達靶向間皮素的CAR（包括CAR-M），治療復發(fā)/難治性卵巢癌和腹膜間皮瘤患者，目前正在招募志愿者進(jìn)行I期臨床試驗。

       關(guān)于CAR-M的臨床轉化，有幾個(gè)方面需要注意：第一，CAR-M的安全性和有效性是該療法的基礎，雖然已經(jīng)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗進(jìn)行了驗證，但CAR-M在人體內的安全性和有效性仍有待驗證；其次，可靠的細胞來(lái)源和擴增是CAR-M臨床應用的必要條件，CAR-M可由PBMC或iPSCs制備。此外，與T細胞不同，巨噬細胞發(fā)生GVHD的風(fēng)險較低，這意味著(zhù)可以提前生產(chǎn)產(chǎn)品，供患者按需使用。第三，還有一個(gè)問(wèn)題必須考慮，目前，CAR-M多采用病毒轉染的方法，可能會(huì )誘發(fā)插入突變， CRISPR/Cas9為解決這一問(wèn)題提供了新的可能性，僅需一周即可完成CAR-T基因的編輯。

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       CAR-M的優(yōu)勢與挑戰

       與CAR-T和CAR-NK細胞相似，CAR-M細胞由識別特定腫瘤抗原的細胞外信號傳導域、跨膜區域和細胞內激活信號區域組成。目前，對細胞外信號域的研究主要幾種在幾種常見(jiàn)的腫瘤靶點(diǎn)，如CD19和HER2。

       與CAR-T細胞不同，CAR-M細胞具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

       1）由于腫瘤細胞周?chē)|(zhì)形成的物理屏障，T細胞不能進(jìn)入腫瘤環(huán)境，而巨噬細胞可以明顯地浸入腫瘤環(huán)境中。TAM在腫瘤侵襲、轉移、免疫抑制和血管生成中起著(zhù)重要作用。CAR-M能降低TAM的比例，影響TAM的細胞表型，對腫瘤的治療有積極作用。

       2）CAR-M除了具有吞噬腫瘤細胞的作用外，還具有促進(jìn)抗原提呈能力和增強T細胞殺傷的作用。

       3）與CAR-T相比，CAR-M的循環(huán)時(shí)間有限，非腫瘤靶向毒性較小。

       盡管CAR-M有很大的潛力成為一種強有力的腫瘤免疫治療方法，但要達到預期的效果還需要克服許多問(wèn)題。首先是細胞數量的限制：無(wú)論是在體外還是在體內注射后，巨噬細胞都不會(huì )增殖?；颊咧荒芙邮苡邢迶盗康木奘杉毎?，這可能會(huì )影響治療效果。二是與巨噬細胞在體內的遷移特性有關(guān)。注射后，外源性巨噬細胞通過(guò)肺部，然后大部分留在肝臟，不利于癌癥的治療。三是復雜的腫瘤微環(huán)境。盡管CAR-M在小鼠模型中取得了很好的效果，但人類(lèi)實(shí)際的腫瘤微環(huán)境要比動(dòng)物模型復雜得多。最后，由于腫瘤細胞的高度異質(zhì)性，靶抗原的表達可能不夠。這一問(wèn)題在CAR-T治療中一直非常突出。臨床研究發(fā)現，大多數被CAR-T細胞去除的腫瘤細胞都有高水平的靶抗原表達?？梢灶A見(jiàn)，這也將成為CAR-M療法發(fā)展的一大障礙。

       — 小結 —

       NK細胞是一類(lèi)獨特的抗腫瘤效應細胞，具有不受 MHC 限制的細胞毒性、產(chǎn)生細胞因子和免疫記憶等功能。CAR-NK細胞療法是一個(gè)很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。CAR-M療法在動(dòng)物實(shí)驗中已顯示出其有效的抗腫瘤能力。與CAR-T和CAR-NK相比，CAR-M作為一種新的細胞免疫療法有其獨特的優(yōu)勢，但也有許多不足需要克服。因此，在今后的臨床治療中應注意最大限度地提高CAR-M的有效性和安全性。我們有理由相信，隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，CAR-NK和CAR-M很快將在患者身上顯示出療效，為腫瘤免疫治療再添助力！