當前核酸藥物開(kāi)發(fā)可分為化學(xué)改造和物理改性?xún)纱蠓较?，二者可單獨或共同提升核酸藥物體內外穩定性和特定組織、細胞內的翻譯效率。目前已開(kāi)發(fā)出多種核酸改造和遞送技術(shù)，主要包括化學(xué)修飾、配體偶聯(lián)和納米遞送載體。

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       納米遞送載體

       1、無(wú)機納米載體

       無(wú)機納米載體是以無(wú)機物為主體的遞送系統，常用的無(wú)機納米材料有金、銀、磷酸鈣、氧化石墨烯、量子點(diǎn)和磁性納米材料如氧化鐵等。無(wú)機納米材料因其獨特的電學(xué)、光學(xué)性質(zhì)和生物相容性以及低細胞毒性的特點(diǎn)而備受關(guān)注。金納米材料具有柔性表面，可以使核酸直接與金納米粒結合。有學(xué)者利用i-motif 二級結構制作一種pH敏感的siRNA-金納米粒遞送系統，可通過(guò)siRNA沉默 PLK1（編碼穩定染色體和有絲分裂所必需的酶），進(jìn)而誘導靶細胞凋亡。pH 梯度變化可引起核酸構象改變，誘導 siRNA-金納米粒聚集，促進(jìn)體內逃逸，從而釋放 siRNA。干細胞難以攝取外來(lái)物質(zhì)，很難使用傳統的非病毒載體進(jìn)行藥物遞送。研究利用HIV-TAT肽對金納米粒和銀納米粒進(jìn)行功能化修飾，載體可以有效穿透表皮干細胞，且毒性較低。量子點(diǎn)是一種基于半導體的單分散納米晶體，碳量子點(diǎn)是其中最典型的應用之一，其尺寸通常小于 10 nm，碳量子點(diǎn)具有低毒性、高量子產(chǎn)率、低光漂白、良好的水溶性、易于表面修飾和化學(xué)性能穩定的特點(diǎn)。PEI、乙二胺、精胺和精氨酸等表面修飾已廣泛應用于碳量子點(diǎn)，且攜帶陽(yáng)離子化合物的碳量子點(diǎn)可以有效地將治療性質(zhì)粒轉染到細胞中。碳量子點(diǎn)可用于癌癥靶向治療，利用葉酸修飾摻雜了氮的碳量子點(diǎn)，與自噬抑制劑組合，可實(shí)現快速（24 h內）抑制腫瘤細胞生長(cháng)且殺傷效果顯著(zhù)。另外，碳量子點(diǎn)還可以作為一種高效的熒光探針，實(shí)現核酸標記和體內動(dòng)態(tài)分布的實(shí)時(shí)跟蹤。例如用脂質(zhì)體包裹碳量子點(diǎn)可用于血管中腫瘤擴增的成像，運用碳量子點(diǎn)來(lái)遞送 siRNA 可進(jìn)行“可視化”的肺癌治療。石墨烯是碳的同素異形體，由于其獨特的光學(xué)、熱學(xué)和電學(xué)特性，成為一種新型納米材料。氧化石墨烯存在 π-π 堆疊非共價(jià)相互作用，可以提高藥物裝載能力并實(shí)現受控釋放。由PEG、PEI 和氧化石墨烯組成的一種刺激響應型核酸遞送載體，氧化石墨烯納米粒吸收近紅外輻射時(shí)，局部溫度升高，導致內體破裂，實(shí)現受控釋放。同時(shí)，氧化石墨烯具有較高負載力，可以將氧化石墨烯、PEI 和聚 4-苯乙烯磺酸鈉組裝成納米復合物來(lái)同時(shí)遞送 miRNA 藥物和抗癌藥物阿霉素。

       2、脂質(zhì)納米顆粒遞送系統

       基于脂質(zhì)的納米載體是核酸藥物遞送領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。脂質(zhì)本身即是細胞膜的主要成分，其易于與細胞膜的磷脂雙分子層相融合，可以提高納米載體的細胞攝入。而且，脂質(zhì)易于購買(mǎi)、生物相容性好、可生物降解，還可以通過(guò)化學(xué)修飾提高載體靶向性。目前研究涉及的脂質(zhì)納米載體包括脂質(zhì)復合物（lipoplex）、脂質(zhì)聚合物復合物（lipopolyplex）、層狀納米顆粒（layer-by-layer nanoparticle，LbLNP）、固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、納米結構脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier，NLC），以及穩定的核酸脂質(zhì)粒子（stable nucleic acid-lipid particle，SNALP）等。

       ①脂質(zhì)復合物。通過(guò)電性吸引將核酸藥物與陽(yáng)離子脂質(zhì)，如溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基銨（DOTAP）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（DOTMA）等混合后直接形成脂質(zhì)復合物是最簡(jiǎn)單的遞送思路。脂質(zhì)復合物的表面帶正電荷，便于結合帶負電荷的細胞膜繼而進(jìn)入細胞，但其在體內環(huán)境中會(huì )與帶負電荷生物大分子發(fā)生作用，導致帶負電荷的核酸藥物被置換從而發(fā)生泄漏，同時(shí)產(chǎn)生電荷相關(guān)的生理毒性。另外，脂質(zhì)復合物劑型穩定性不理想，需要在使用前即時(shí)配制。

       ②脂質(zhì)聚合物復合物。脂質(zhì)聚合物復合物系將陽(yáng)離子聚合物，如聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴(lài)氨酸（PLL）、聚精氨酸、聚酰胺-胺樹(shù)形分子（PAMAM dendrimer）等與核酸藥物形成的表面帶正電的聚合物復合物通過(guò)電性吸引包裹脂質(zhì)雙分子層得到，形成的納米顆粒表面基本不帶正電荷。相較于脂質(zhì)復合物，脂質(zhì)體聚合物復合物可以顯著(zhù)提高遞送效率，且穩定性明顯提高。通過(guò)加入透明質(zhì)酸或肝素對復合物表面進(jìn)行修飾，其免疫刺激性可進(jìn)一步降低。

       ③層狀納米顆粒。層狀納米顆粒通過(guò)序列的電性作用將核酸藥物包裹進(jìn)多層的納米顆粒。中心穩定的納米核心及各層材料的選擇對相鄰層之間的吸附至關(guān)重要。如使用電負性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）顆粒作為核心，首先將聚精氨酸（poly-L-Arg）吸附至核心表面以產(chǎn)生帶正電荷的表面，再以電負性的siRNA 進(jìn)行覆蓋，再覆蓋一層帶正電荷的聚精氨酸，最后用偶聯(lián)了 CD20 抗體的帶負電荷的透明質(zhì)酸覆層。該多層納米顆粒最外層的負電荷層可以避免產(chǎn)生正電荷相關(guān)毒性，其在動(dòng)物實(shí)驗中未見(jiàn)明顯的毒性。但層狀納米顆粒的材料選擇要求較高且制備工藝復雜、重現性差，限制了其應用。

       ④固體脂質(zhì)納米粒（SLN）和納米結構脂質(zhì)載體。固體脂質(zhì)納米粒具有低熔點(diǎn)的固體陽(yáng)離子脂質(zhì)核心，核酸藥物吸附于載體基質(zhì)表面，通過(guò)外圍的表面活性劑使之穩定。但研究發(fā)現，SLN 可能會(huì )隨著(zhù)內部固體脂質(zhì)晶體的逐漸生長(cháng)導致藥物泄漏。納米結構脂質(zhì)載體為其升級版本，在基質(zhì)中摻入少量的液體脂質(zhì)，降低了脂質(zhì)核心的結晶程度，不僅提高了載藥量，還具有更好的物理和化學(xué)穩定性。由于固態(tài)脂質(zhì)核也可進(jìn)行載藥，固體脂質(zhì)納米粒和納米結構脂質(zhì)載體可以對親脂性藥物進(jìn)行遞送。使用固體脂質(zhì)納米粒對Bcl-2 siRNA 和紫杉醇同時(shí)包載，體外結果顯示這2種藥物可以同時(shí)釋放。

       ⑤穩定的核酸脂質(zhì)粒子。穩定的核酸脂質(zhì)粒子（SNALP）是一種含有可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米粒（LNP），由正電/可離子化脂質(zhì)、結構脂質(zhì)、PEG 脂質(zhì)及膽固醇組成，可有效阻止核酸藥物在內源性環(huán)境中的降解，將藥物遞送至細胞內?；谄浼夹g(shù)和商業(yè)上的成功導致的巨大影響，許多文獻中的LNP均特指SNALP。LNP粒徑通常為20～200 nm，該大小可幫助LNP 克服體液 (如血液和淋巴液) 的剪切并穿過(guò)組織間隙。研究表明，LNP 在體內主要通過(guò)與載脂蛋白E (apoli‐poprotein E，ApoE) 形成復合物，在低密度脂蛋白受體介導的內吞后由CLs/ILs 介導的內體逃逸進(jìn)入細胞質(zhì)。LNP 的體內分布與處方及相關(guān)受體密切相關(guān)，LNP 的處方研究是當前 RNA 遞送的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

       目前，已有3個(gè)使用此類(lèi)遞送系統的產(chǎn)品獲批上市，分別為阿尼拉姆公司開(kāi)發(fā)的治療遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）的 siRNA 藥物 patisiran（商品名：Onpattro），以及用于預防新冠病毒感染的mRNA疫苗 Comirnaty 和 Spikevax?？呻x子化陽(yáng)離子脂質(zhì)的使用和微流控混合技術(shù)的出現使得載藥顆粒的表面基本不帶電?？呻x子化陽(yáng)離子脂質(zhì)在酸性條件下帶正電荷，而在體內循環(huán)系統的環(huán)境中幾乎不帶電。脂質(zhì)納米粒制備時(shí)，在pH 約4的條件下，通過(guò)快速混合脂質(zhì)的乙醇溶液和核酸的水溶液，可形成實(shí)心的脂質(zhì)顆粒。將其透析除去乙醇后，于近中性的水溶液中保存備用，脂質(zhì)顆粒表面近中性。

       SNALP 通過(guò)一系列巧妙的設計獲得了商業(yè)上的成功，但其存在的問(wèn)題也比較明顯。首先，其遞送效率有限，為達到治療效果需要較高的給藥劑量。但是，作為一種使用了多種脂質(zhì)輔料的注射劑，輔料的毒性不可忽視。另外，PEG 脂質(zhì)被報道可引起超敏反應，陽(yáng)離子脂質(zhì)也具有一定的促炎性。例如，Onpattro 在注射之前需要使用抗組胺藥和激素藥物控制。隨著(zhù)同樣靶向肝臟的更高效遞送系統-N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶聯(lián)遞送系統的出現，SNALP 已逐漸退出 siRNA遞送領(lǐng)域。但對于生物利用度更差、荷電更高的mRNA及CRISPR 基因編輯藥物，LNP遞送系統目前仍是解決其遞送難題最有效的方式。

       經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀的積累，遞送技術(shù)逐漸成熟，使核酸藥物進(jìn)入了快速增長(cháng)期。核酸藥物在治療遺傳性疾病方面具有天然優(yōu)勢，為眾多罕見(jiàn)病患者提供了寶貴的治療機會(huì )。核酸藥物遞送技術(shù)的發(fā)展呈現出平臺化的特點(diǎn)，在遞送技術(shù)相對成熟后，基于相同技術(shù)平臺開(kāi)發(fā)類(lèi)似藥物的速度會(huì )明顯加快。如借助前期脂質(zhì)納米粒的技術(shù)沉淀，Moderna公司的mRNA 新冠疫苗從疫苗序列選擇設計完成到首次人體給藥，合計僅耗時(shí)63 d，展現了超乎以往想象的效率?？梢灶A見(jiàn)，已有的技術(shù)平臺未來(lái)也非常有希望應用于體內基因編輯等新的治療領(lǐng)域。同時(shí)，核酸藥物的遞送仍面臨眾多技術(shù)挑戰。如何進(jìn)一步提高遞送效率、降低遞送系統的毒性、實(shí)現對其他肝臟外組織和器官的特異性遞送將是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。伴隨著(zhù)對核酸體內作用機制和相關(guān)疾病認識的進(jìn)一步深入，核酸藥物遞送系統必將迎來(lái)新的突破和發(fā)展，助力于提供安全有效的個(gè)性化治療方案，使更多患者受益。

       參考資料

       [1]陳歡，魏利軍.RNA藥物非病毒遞送系統研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2022，46(11):

       [2]李丹，黃宇坤，高小玲.RNA藥物遞送研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報，2023，58(03):

       [3]王峻峰，譚曼曼，王穎等.核酸類(lèi)藥物的修飾和遞送研究進(jìn)展[J].浙江大學(xué)學(xué)報(醫學(xué)版)，2023，52(04):

       作者簡(jiǎn)介：小米蟲(chóng)，藥品質(zhì)量研究工作者，長(cháng)期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗證工作，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證