靶向蛋白降解(Targeted protein degradation, TPD)作為一種新興的治療策略被廣泛關(guān)注，它可以靶向以前被認為“不可成藥”的蛋白質(zhì)。PROTAC是TPD的主要焦點(diǎn)，它同時(shí)招募并結合E3連接酶和靶蛋白(POI)，從而形成E3-降解蛋白POI三元復合物，誘導POI泛素化和隨后的蛋白體降解。
鑒于PROTAC巨大的治療潛力和獨特的機制，該領(lǐng)域引起了學(xué)術(shù)界和制藥行業(yè)的極大興趣，目前已有250種藥物被PROTACs進(jìn)行降解測試。盡管PROTAC具有廣泛的治療潛力，但在人類(lèi)基因組的數百種E3連接酶中，目前只有不到2%的E3連接酶參與了TPD領(lǐng)域的研究，因此，需要招募更多的E3連接酶來(lái)進(jìn)一步增強TPD的治療潛力。
近日，美國國家癌癥中心的Eytan Ruppin教授和印第安納大學(xué)醫學(xué)院生物統計與健康數據科學(xué)系Leng Han教授團隊研究人員對1075個(gè)E3連接酶進(jìn)行了表征，最終確定了76種有潛力的E3連接酶，擴展了PROTAC的E3連接酶版圖，推動(dòng)了PROTACs藥物的開(kāi)發(fā)進(jìn)展。
研究人員收集了E3連接酶的綜合列表(圖1a)，并利用大規模數據資源、實(shí)驗證據和人工智能(AI)工具來(lái)描繪E3連接酶的七個(gè)不同的關(guān)鍵維度：
化學(xué)配位性，表征E3連接酶的粘合劑可用性;
E3連接酶在腫瘤和正常樣本中單細胞水平和整體水平的表達模式;
進(jìn)一步表征其潛在蛋白靶點(diǎn)的E3連接酶的PPI;
在PROTAC設計中應優(yōu)先考慮的其他重要因素，包括結構可用性、功能必要性、細胞定位和E3連接酶的PPI接口(圖1b)。
之后，他們基于三十個(gè)大規模數據集分析，包括3個(gè)E3連接酶列表、5個(gè)配體庫、5個(gè)表達圖譜、7個(gè)互作數據庫、2個(gè)結構數據庫、2個(gè)重要性篩選、3個(gè)細胞定位數據庫和3種互作界面數據庫，研究人員揭示了幾種有前途的現存的E3連接酶。
PART.
01
化學(xué)配位性
表征E3連接酶的粘合劑可用性
為了尋找可能促進(jìn)E3連接酶募集的新的藥物，研究人員采用基于深度學(xué)習的虛擬篩選配體模型HyperAttentionDTI31，在DrugBank25中搜索E3連接酶與藥物之間潛在的相互作用。
在評估和應用該模型后，研究人員獲得了預測的藥物-靶標相互作用，包括潛在的新型E3連接酶，如Makorin Ring Finger Protein 1 (MKRN1)，與關(guān)鍵腫瘤驅動(dòng)因子TP53和APC32具有ppi，并預測與DB13955(雌 二醇二酸酯)和DB03017(月桂酸)相互作用。利用這些藥物可能會(huì )增加潛在的新型E3連接酶的配體性，從而靶向其他腫瘤靶點(diǎn)。他們系統分析利用了五個(gè)大規模的數據源，并揭示了許多新的E3連接酶和數十種可用的配體，這些配體可能用于PROTAC的開(kāi)發(fā)。
PART.
02
E3連接酶在腫瘤和正常樣本中
單細胞及整體水平的表達模式
通過(guò)對腫瘤和正常組織的整合分析，研究人員確定了206個(gè)E3連接酶，包括3個(gè)增選的和203個(gè)新的E3連接酶，它們在TCGA和HPA病理中至少一種腫瘤類(lèi)型中高表達，而在GTEx和Tabula及大多數正常組織中低表達。除了這3種被采用的E3連接酶，這203種潛在的新型E3連接酶揭示了一個(gè)大型的E3連接酶庫，可用于抗癌PROTAC的開(kāi)發(fā)。
研究人員全面描繪了大細胞水平和單細胞水平的轉錄組表達，以及E3連接酶的蛋白質(zhì)組表達，證明了利用大規模表達數據進(jìn)一步推進(jìn)PROTAC提高療效和規避副作用的必要性。
PART.
03
E3連接酶與POI蛋白
相互作用(PPI)的綜合圖譜
蛋白質(zhì)被PROTAC降解的可能性因靶蛋白而異，總結E3連接酶相關(guān)的ppi應優(yōu)先考慮能被PROTAC高降解的靶蛋白。為了確定這些PROTAC靶點(diǎn)，研究人員將PROTACtable基因組和基于模型的蛋白質(zhì)降解性分析(MAPD)兩項研究的結果結合起來(lái)，對靶點(diǎn)的PROTACtable可降解性進(jìn)行了評估。這兩項研究突出了3280個(gè)PROTAC可處理靶點(diǎn)，其中1025個(gè)靶點(diǎn)重疊。
研究人員還發(fā)現了一些PPIs涉及PROTAC可治療的癌癥靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)尚未在PROTAC中被探索。例如，神經(jīng)母細胞瘤RAS(NRAS)與轉移性結直腸癌的不良預后相關(guān)，有證據表明PPIs具有增選的E3連接酶BIRC2和XIAP，以及潛在的新型E3連接酶CDC20和SKP2。另一個(gè)PROTAC可處理的靶點(diǎn)是Rac Family Small GTPase 1 (RAC1)，它誘導乳腺癌的化療耐藥，與增選的E3連接酶MDM2和XIAP以及潛在的新型E3連接酶ITCH和SMURF2相互作用。在開(kāi)發(fā)針對這些癌癥靶點(diǎn)的PROTACs時(shí)，可以考慮相應的E3連接酶。
PART.
04
E3連接酶的結構可用性、
功能必要性、細胞位置和PPI接口
首先，為了獲得E3連接酶的可用蛋白質(zhì)結構，研究人員查詢(xún)了世界范圍內的結構數據庫protein Data Bank (PDB)，鑒定出414個(gè)具有實(shí)驗確定結構的E3連接酶。這些可用的蛋白質(zhì)結構，為招募潛在的新E3連接酶提供了很好的機會(huì )。
然后，研究人員利用依賴(lài)圖譜(DepMap)61中的CRISPR和RNAi技術(shù)，研究了E3連接酶的遺傳擾動(dòng)，評估了癌細胞系中基因的必要性。他們在CRISPR篩選中鑒定出146個(gè)腫瘤必需的E3連接酶，包括兩個(gè)增選的E3連接酶——VHL和RNF4。
緊接著(zhù)，為了確定E3連接酶的細胞位置，研究人員整合了來(lái)自COMPARTMENTS、Gene Ontology (GO)和UniProt的高質(zhì)量數據。發(fā)現983個(gè)E3連接酶被細胞質(zhì)和/或細胞核注釋?zhuān)@被認為是PROTAC的首選位置。這些潛在的新型E3連接酶，為實(shí)現受限或需要降解的亞細胞定位提供了一種通用的選擇。
最后，研究人員從多種來(lái)源收集到跨越928個(gè)E3連接酶，包括11個(gè)增選的E3連接酶的PPI界面?；诖丝梢灾笇藗兇_定E3連接酶或靶標中觀(guān)察到的突變是否位于界面區域，從而可能進(jìn)一步破壞E3連接酶與靶標的相互作用。
PART.
05
局限與展望
然而，此研究目前也有一定的局限性，首先針對E3連接酶的研究主要集中在有限數量的E3連接酶上，如VHL/CRBN，缺少其他蛋白經(jīng)驗；其次由于目前缺乏大規模的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)數據，無(wú)法更高分辨分析E3連接酶的活性，最后翻譯后修飾(PTM)在調節E3連接酶的活性和豐度（豐度指的是E3連接酶的相對含量）方面也起著(zhù)關(guān)鍵作用。
PTM對PROTAC中E3的調控作用在很大程度上是未知的，大規模的高分辨率PTM數據還無(wú)法實(shí)現。因此，該網(wǎng)站為用戶(hù)提供了根據他們的偏好選擇數據源的選項。除了為PROTAC尋找新的E3連接酶外，E3連接酶的信息也可以被其他TPD領(lǐng)域所利用，如蛋白水解靶向抗體(PROTAB)和分子膠。
總之，該研究通過(guò)分析30個(gè)大規模數據集，從7個(gè)不同的方面系統地表征了E3連接酶，包括化學(xué)配體性、表達模式、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)、結構可用性、功能必要性、細胞位置和PPI接口。揭示了幾種有前途的現存的E3連接酶。綜合置信度評分、配位性、表達模式和PPI，確定了76個(gè)E3連接酶作為PROTAC相互作用的候選酶。
此外，盡管新開(kāi)發(fā)的PROTAC大部分用于癌癥治療，但研究人員對E3連接酶的綜合分析也可以從癌癥轉移到其他領(lǐng)域的治療開(kāi)發(fā)，例如：治療神經(jīng)和/或免疫疾病。期待E3連接酶能夠持續助力PROTAC藥物的開(kāi)發(fā)，造福更多患者！
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