前蛋白轉換酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)是一種由肝 臟合成分泌的絲氨酸蛋白酶，可以與低密度脂蛋白受體(LDLR)結合，從而在細胞內吞時(shí)將其運輸到溶酶體，并促進(jìn)細胞內降解以防止其再循環(huán)。然而，如果循環(huán)過(guò)程中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平異常升高，將會(huì )容易引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性的心血管疾病(ASCVD)。因此，將PCSK9作為治療靶點(diǎn)，設計出調節血漿LDL-C水平以預防ASCVD的新藥是目前一種新興的治療方法之一。

       本文主要重點(diǎn)介紹了基于多肽的PCSK9抑制劑的結構特點(diǎn)和設計、對患者的治療作用、以及PCSK9的調節機制，以及抗PCSK9肽作為一種有希望替代單克隆抗體（MABs）來(lái)調節LDL-C水平的藥物，正在成為一種有前途的新一代治療方法。

       背景介紹

       患上動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的患者估計每年在護理、藥物和生產(chǎn)力損失方面的成本可能就要超過(guò)2000億美元，同時(shí)它也是美國的頭號死亡原因。高脂血癥是ASCVD的一個(gè)公認的風(fēng)險因素，包括動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、心力衰竭、心肌梗死(MI)和冠心病(CHD)。

       與健康人相比，高膽固醇[低密度脂蛋白膽甾醇（LDL-C）升高]的人患心臟病的風(fēng)險增加2倍。美國高LDL-C成年人的人數為7370萬(wàn)，即31.7%。在接受治療（他汀單獨或聯(lián)合依折麥布）的約48.1%的高LDL-C患者中，只有29.5%的受試者病情得到控制。家族性高膽固醇血癥(FH)是導致LDL-C終身升高和冠心病風(fēng)險顯著(zhù)增高的常見(jiàn)形式。

       前蛋白轉換酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型（proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9，PCSK9)被發(fā)現為FH的遺傳決定因素，近年來(lái)成為降低高膽固醇血癥患者LDL-C水平的潛在靶點(diǎn)。PCSK9通過(guò)降解低密度脂蛋白受體(LDLR)來(lái)調節血清中LDL-C水平。因此，PCSK9抑制劑已成為一種血脂控制新療法，可減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機制，降低心血管事件和死亡率。

       PCSK9在血管壁、腸、腎和腦中表達，在這些組織中，除了提高脂質(zhì)外，它還參與了其它的功能，盡管有新的證據表明PCSK9可以發(fā)揮多種多效性作用，但它的主要功能仍然是控制膽固醇的穩態(tài)。（圖1）

       圖1. PCSK9發(fā)揮多效性效應的示意圖。

       高膽固醇血癥的治療

       許多降脂療法已顯示出治療高脂血癥的積極結果。其中以羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoAR）抑制劑（他汀類(lèi)藥物）、膽固醇酯轉移蛋白抑制劑（anacetrapib）、膽固醇吸收抑制劑（依折麥布）、和PCSK9抑制劑等為代表。

       如果飲食和生活方式的改善未能降低LDL-C水平，通常通過(guò)他汀類(lèi)藥物作為一線(xiàn)藥物治療。然而，他汀類(lèi)藥物治療與不良副作用相關(guān)，包括他汀類(lèi)藥物相關(guān)肌肉癥狀、肝毒 性、發(fā)生2型糖尿病的可能性和出血性卒中風(fēng)險。此外，約50%使用他汀類(lèi)藥物的個(gè)體無(wú)法將其LDL-C水平降低至預期水平，從而使患者發(fā)生腦血管疾病的風(fēng)險升高。

       此外，他汀類(lèi)藥物治療可上調PCSK9，進(jìn)一步降低他汀類(lèi)藥物的有效性。依折麥布是降低LDL-C的二線(xiàn)藥物，可阻止腸道吸收膽固醇。對于接受最高劑量他汀類(lèi)藥物治療但仍需要額外降低LDL-C的個(gè)體或他汀類(lèi)藥物不耐受的患者，則需要依折麥布作為輔助治療。在LDL-C和FH水平最高的個(gè)體中，高強度他汀類(lèi)藥物單藥治療或與依折麥布聯(lián)合治療不足以達到預期的LDL-C水平。

       而PCSK9抑制劑比他汀類(lèi)藥物的優(yōu)勢是，他汀類(lèi)藥物不會(huì )顯著(zhù)降低脂蛋白(a) [LP(a)]水平，這是腦血管疾?。–VD）的一個(gè)獨立危險因素，而PCSK9抑制劑則會(huì )降低。這是因為PCSK9參與LDL相關(guān)蛋白-1的降解，該蛋白分解LP(a)，因此，抑制PCSK9會(huì )提高LDL相關(guān)蛋白-1的水平，從而增加LP(a)的分解。在表1中對比了他汀類(lèi)藥物和PSCK9抑制劑的臨床治療影響。

       表1. 高強度他汀類(lèi)藥物和PCSK9抑制劑對臨床血漿參數影響的觀(guān)察

       PCSK9

       3.1 PCSK9的結構與生物學(xué)功能

       PCSK9是絲氨酸蛋白酶家族的第九個(gè)也是最后一個(gè)成員，該家族包括原蛋白轉化酶1(PC1)，PC2，PC4，PC5，PC7，Furin,配對堿性氨基酸裂解酶4(PACE4)，枯草桿菌蛋白酶Kexin同工酶1和PCSK9.這個(gè)絲氨酸蛋白酶家族更類(lèi)似于細菌枯草桿菌蛋白酶。前八個(gè)轉化酶(PC1到SKI-1)裂解分泌性蛋白前體以產(chǎn)生調節發(fā)育和代謝的生物活性肽、多肽和激素。

       然而，PCSK9自身裂解，不再作為蛋白酶發(fā)揮作用。相反，它起非酶作用，并增強LDLR的內體和溶酶體降解（在LDL-C穩態(tài)中至關(guān)重要）。人PCSK9(hPCSK9)基因編碼72kDa的酶原，含692個(gè)氨基酸，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內含子組成。11個(gè)PCSK9具有信號肽、原結構域、與枯草桿菌蛋白酶相似的催化結構域(CD)和絲氨酸蛋白酶中具有獨特折疊的可變C端結構域。

       PCSK9蛋白的晶體結構如圖2A(PDB:2PMW)所示?？刂芇CSK9細胞定位的基序可能存在于羧基末端結構域（殘基452至692）中，其特征是富含半胱氨酸和組氨酸的區域(CHRD)。該結構域與抵抗素同型三聚體具有結構相似性，抵抗素同型三聚體是一種與糖尿病和肥胖有關(guān)的微小細胞因子，對PCSK9-LDLR復合體的內溶酶體降解至關(guān)重要。產(chǎn)生的PropCSK9在VFAQ152SIP位點(diǎn)經(jīng)歷了自催化裂解，形成了一個(gè)13 kDa的前結構域和一個(gè)成熟的PCSK9結構域（圖2B），為了使PCSK9在生物學(xué)上運作，需要原結構域和PCSK9的異源二聚體，但不需要PCSK9的酶活性為了防止催化三聯(lián)體排列和保護鄰近的蛋白質(zhì)免受其絲氨酸蛋白酶活性的影響，PCSK9的蛋白酶活性被抑制。成熟的PCSK9在肝細胞外以一種完整的異源二聚體(62+13kDa)的形式分泌。PCSK9已被證明在控制膽固醇穩態(tài)方面具有重要功能。

       PCSK9最顯著(zhù)的特征是它與LDLR的EGF-A結構域相互作用，并通過(guò)將其引導到溶酶體來(lái)促進(jìn)受體降解。PCSK9:EGF-A復合物的晶體結構如（圖2C）所示(PDB:3bps)。值得注意的是，與PCSK9的起源無(wú)關(guān)，LDLR調節其從等離子體中的清除。LDLR當附著(zhù)在LDL-C上時(shí)，進(jìn)入細胞，然后在內體中與LDL-C解離，如果不與PCSK9偶聯(lián)，最終會(huì )穿梭到細胞表面。

       圖2. (A) PCSK9蛋白的晶體結構顯示了多種結構域，包括原結構域（綠色）、C端結構域（棕色）和類(lèi)似枯草桿菌蛋白酶的催化結構域（PDB:2PMW)。(B) PCSK9在肝細胞中成熟過(guò)程示意圖。(C) PCSK9:EGF-A復合體的晶體結構表明了EGF-A結構域的fldlr(藍色)和PCSK9的不同結構域(PDB: 3BPS)。

       3.2 PCSK9在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用

       動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是一種脂蛋白驅動(dòng)的疾病，其特征是動(dòng)脈壁內膜增生、炎癥、壞死和鈣化。肝、腎和小腸是循環(huán)PCSK9的主要來(lái)源。PCSK9也由內皮細胞、血管平滑肌細胞(VSMC)合成，并在較小程度上由巨噬細胞合成。這些觀(guān)察表明，用PCSK9刺激的巨噬細胞可能抑制泡沫細胞的形成，從而形成動(dòng)脈粥樣硬化。結合這些發(fā)現將PCSK9與斑塊的形成聯(lián)系起來(lái)。隨著(zhù)巨噬細胞從單核細胞（幾乎無(wú)法檢測到）到分化單核細胞（在那里高表達）再到完全分化的巨噬細胞，PCSK9基因在巨噬細胞中的表達逐漸增加。有趣的是，用Evolocumab抑制PCSK9改善了HIV+血脂異?；颊叩墓跔顒?dòng)脈內皮功能。當HPCSK9通過(guò)增強骨髓來(lái)源的LY6ChIgH單核細胞的病變浸潤而改變斑塊結構，進(jìn)而導致它們以L(fǎng)DLR依賴(lài)的方式分化為巨噬細胞時(shí)，PCSK9可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成中的炎癥的想法首次被實(shí)現。

       這些結果與HPCSK9表達增加脂多糖刺激的小鼠腹腔巨噬細胞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)mRNA表達的事實(shí)一致，這一事實(shí)后來(lái)在原代人巨噬細胞中得到證實(shí)。

       PCSK9的缺失導致了一種通過(guò)LDLR以外的途徑易感動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠品系中致動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白較少的表型。LDLR、APOBEC1和PCSK9缺失小鼠的脂蛋白暴露于內皮細胞后，內皮細胞產(chǎn)生的ICAM-1、IL-1β和趨化因子（包括CCL2和CCL-7）減少，所有這些都促進(jìn)了單核細胞向血管壁的粘附和浸潤。在參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥負擔的眾多炎癥因子和清道夫受體中，凝集素氧化脂蛋白-1(LOX1)起主導作用。

       LOX-1與PCSK9呈正相關(guān)，LOX-1促進(jìn)PCSK9，PCSK9促進(jìn)LOX-1和氧化LDL的吸收。此外，小鼠重組PCSK9可促進(jìn)TNF-α誘導的巨噬細胞中清除受體（如CD36和LOX-1)的表達和氧化LDL的吸收。LDLR相關(guān)家族，如LRP5，也有助于脂質(zhì)內化到巨噬細胞中。盡管PCSK9和LRP5不會(huì )改變彼此的表達，但它們在核周區域的共定位允許它們直接相互作用。免疫沉淀研究表明，聚集的LDL刺激促進(jìn)脂質(zhì)負載巨噬細胞的形成。

       如前所述，樹(shù)突狀細胞或巨噬細胞中脂蛋白產(chǎn)生的脂質(zhì)的積累激活了一種稱(chēng)為炎癥體的多蛋白復合物。人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化病變具有三個(gè)結構域的增加表達，這三個(gè)結構域組成核苷酸寡聚結構域(NOD)、富含亮氨酸重復(LRR)和NLR家族含pyrin結構域(NLRP3)炎癥體：末端pyrin結構域、中央核苷酸結構域（NACHT結構域）和C末端富含賴(lài)氨酸結構域。NLRP3復合物的形成導致自催化Caspase 1激活。在炎癥和PCSK9之間的糾纏相互作用中，γ干擾素促進(jìn)mRNA表達，而NLRP3途徑調節PCSK9分泌。在不產(chǎn)生LDLR基因敲除的情況下，研究轉基因或敲除小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機制的體內實(shí)驗進(jìn)一步支持了PCSK9在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的關(guān)鍵參與。

       3.3抗PCSK9的藥物類(lèi)型

       PCSK9抑制劑是利用針對PCSK9生產(chǎn)、加工和結合的策略開(kāi)發(fā)的，以控制循環(huán)LDL-C水平（圖3）。開(kāi)發(fā)小分子的常規方法尚未對 PCSK9 有效。這同樣適用于開(kāi)發(fā)基于蛋白質(zhì)的疫苗接種，這些疫苗可引導免疫系統產(chǎn)生抗 PCSK9 抗體以中和循環(huán)中的 PCSK9。然而這些疫苗也未達到標準預期。因此，探索 CRISPR-Cas9、小干擾核糖核酸 (siRNA)、反義寡核苷酸 (ASO)、單克隆抗體、adnectin、anticalin 和肽等新藥模式的研究勢頭強勁。

       圖3. 針對 PCSK9 生產(chǎn)、加工和與 LDRL 結合以管理 LDL-C 水平的各種藥物類(lèi)型。

       3.3.1抗PCSK9的小分子治療

       使用小分子靶向PCSK9有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括更好的穩定性、更低的生產(chǎn)成本和更簡(jiǎn)單的管理（表2，條目1）。這些小分子通過(guò)阻斷PCSK9:LDLR PPIs,干擾PCSK9的成熟和分泌，或抑制PCSK9的表達來(lái)降低LDL-C。然而，小分子（質(zhì)量500 DA）不能有效抑制PCSK9:EGF-a PPIs，因為PCSK9的表面相對平坦、無(wú)特征且不可成藥。上述假說(shuō)從小分子介導的PCSK9抑制只產(chǎn)生一個(gè)足夠感興趣的潛在候選藥物，即CVI-LM001(1)這一事實(shí)中得到了明顯的證明。CVI-LM001(1)是紫堇堿的氟苯磺酸衍生物，通過(guò)抑制PCSK9基因的表達而起作用（圖4）。在IB期研究(CTR20160744)中，300毫克劑量的CVI-LM001(1)使LDL-C水平升高的參與者的LDL-C水平降低26.3%，TC降低20.1%，載脂蛋白降低17.4%。

       圖4. 臨床小分子抗 PCSK9 療法 1 和 2 的化學(xué)結構。

       表2. PCSK9抑制藥物類(lèi)型的比較

       3.3.2 Adnectin 作為 PCSK9 靶向治療藥物

       Adnectin是為延長(cháng)給藥間隔而開(kāi)發(fā)的新模式。Adnectins是重組融合蛋白，與MABs相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，如體積小、費用低、生產(chǎn)容易、親和力高、起效快（表2,條目7）。在I期臨床研究中，BMS-962476是一種與聚乙烯偶聯(lián)的多肽，使LDL-C水平下降48%，使游離PCSK9下降>90%(NCT01587365)。PCSK9和Adnectin的X射線(xiàn)共晶結構很好的揭示了對PCSK9的抑制機制（BMS-962476的祖細胞）。共晶的每個(gè)晶胞包含兩個(gè)PCSK9-腎上腺素復合物，如圖6A(PDB ID:4OV6)所示。LDLR與PCSK9-Adnectin結構的重疊表明Adnectin 1459D05位于LDL受體結合表面附近，以阻止PCSK9:LDLR PPIs發(fā)揮作用（圖5B)。

       圖5. (A)PCSK9與Adnectin 1459D05的共晶結構顯示一個(gè)包含兩個(gè)PCSK9-Adnectin復合物的晶胞（PDB ID:4OV6)。（B）LDLR（綠色）與PCSK9/Adnectin結構的重疊，表明LDLR與Adnectin之間的空間沖突(PDB ID:3P5C)。

       3.3.3 作為PCSK9靶向治療藥物的多肽

       與其他抑制PCSK9的策略相比，多肽有幾個(gè)好處（表2，條目9）。例如，小分子由于體積小而缺乏選擇性，不能有效地與PCSK9等不可藥物作用的靶點(diǎn)結合。類(lèi)似地，大型生物制劑，如MABS，價(jià)格昂貴，不穩定，缺乏藥物性質(zhì)。相反，多肽治療有一個(gè)理想的大小(500-5000Da)，這使得很容易使它們功能化以增強它們的藥物樣特征，如生物利用度、穩定性、親和力和特異性。進(jìn)一步多肽模擬復雜蛋白質(zhì)的結構，從而允許它們與PCSK9相對平坦和大的表面相互作用以破壞PCSK9:LDLR PPIs。

       此外，多肽治療藥物，像小分子藥物一樣，比大型生物藥物更容易制造，這降低了生產(chǎn)成本。因此，多肽在許多方面占據了小分子和生物藥物之間的獨特位置，并被認為是可能干擾PCSK9功能的重要藥物先導物（圖6）。

       圖6. 使用 BioRender.com 創(chuàng )建的大型生物和小分子療法與肽模式的比較。

       基于PCSK9多肽抑制劑的臨床研究

       兩種肽 PCSK9 抑制劑 MK-0616 (5) 和 NNC03850434 (NN6434, 6) 已進(jìn)入臨床試驗階段。大環(huán)肽以其對蛋白水解降解的高穩定性而聞名，并具有破壞大而扁平目標的 PPI 的固有特性?？紤]到 PCSK9 的 PPI 與 LDLR 的相似特征，LDLR 是一種環(huán)肽抑制劑PCSK9(3)利用mRNA展示技術(shù)被設計（圖7）。然后將HIT肽3優(yōu)化為一種高效的、代謝穩定的PCSK9抑制劑，其分子量降低為4。然后將第二代肽4精制成三環(huán)的、口服生物可用的MK-0616(5)。MK-0616(5)是一種新型大環(huán)化合物，其親水性、抑菌能力（約10萬(wàn)×)和體內活性均優(yōu)于初始先導化合物。在I期臨床研究中，單劑量10-300毫克的MK-0616(5)耐受性良好，并使健康參與者血清中PCSK9水平下降90%。

       另一種治療高膽固醇血癥的基于肽的長(cháng)效PCSK9抑制劑是諾和諾德的NN6434(6)。目前正在對NN6434進(jìn)行多次第一和第二階段臨床研究。2022年，啟動(dòng)了一項I期試驗，以測試三種不同的NN6434(6)片劑配方來(lái)治療高膽固醇血癥(NCT05333107)。在II期臨床試驗中，他們還計劃評估15毫克NN6434(6)對CVD患者的有效性(NCT04992065)。

       圖7. (A)Merck大環(huán)MK-0616(5)的設計和生物活性。(B)與PCSK9上LDLR結合位點(diǎn)結合的4的晶體結構(PDB ID:6XIE)。

       總結與展望

       長(cháng)期以來(lái)由于PCSK9的表面相對平坦且無(wú)特征，因此開(kāi)發(fā)能夠阻止PCSK9與LDLR相互作用的小分子非常具有挑戰性。幸運的是，多肽作為一種特殊的化學(xué)類(lèi)型，為大生物制劑和小分子提供了一種有希望的替代方案，并成為抑制PCSK9的有吸引力的下一代治療藥物。

       為了提高PCSK9抑制劑的剛性、蛋白水解穩定性、細胞通透性和口服生物利用度，許多制藥行業(yè)都在廣泛地研究肽的環(huán)化。例如，最 先進(jìn)和最有效的抗PCSK9肽是大環(huán)，如諾華的13PCSK9I和默克的MK-0616。制藥行業(yè)對開(kāi)發(fā)大環(huán)肽作為PCSK9拮抗劑的興趣和投入加大，進(jìn)一步加強了這種方法治療高膽固醇血癥的治療前景。因此，我們非常期待發(fā)展更多安全有效的PCSK9抑制劑來(lái)造?；颊?。

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