抗體領(lǐng)域無(wú)疑是近幾年最火的研發(fā)領(lǐng)域，不論是從融資金額，融資數量，獲批藥物數量還是從抗體藥物銷(xiāo)售額都可以看出這個(gè)領(lǐng)域的前景和價(jià)值。

       隨著(zhù)抗體技術(shù)的發(fā)展，不僅開(kāi)發(fā)出單克隆抗體，雙特異性抗體，三特異性抗體，也基于抗體開(kāi)發(fā)很多藥物偶聯(lián)物，包括抗體藥物偶聯(lián)物（ADC），肽-藥物偶聯(lián)物（PDC），多肽-藥物偶聯(lián)物 （polyDC），小分子藥物偶聯(lián)物（SMDC）、免疫刺激抗體偶聯(lián)物（ISAC）、抗體片段藥物偶聯(lián)物（FDC）和適體藥物偶聯(lián)物（ApDC）等。

       從全球角度看，全球治療性抗體行業(yè)市場(chǎng)規模持續增長(cháng)，2021年全球治療性抗體市場(chǎng)規模超過(guò)2000億美元，達到2054億美元，同比增長(cháng)15.98%。

       目前單克隆抗體獲批的超過(guò)100種，雙特異性抗體獲批的有8種，三特異性抗體暫時(shí)沒(méi)有獲批，而基于抗體設計的ADC全球獲批已達15種，種種跡象表明抗體巨大的市場(chǎng)和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

       單抗、雙抗和三特異性抗體

       抗體又稱(chēng)免疫球蛋白，是由B淋巴細胞接受刺激后產(chǎn)生的糖蛋白，結構呈“Y”字型，具有特異性結合抗原的功能，在人體抵御外界感染性病原體中發(fā)揮重要作用。

       自1986年第一個(gè)單克隆抗體Orthoclone OKT3被批準用于腎移植受者急性同種異體移植排斥反應的治療，基于抗體的療法數量顯著(zhù)增加，目前超過(guò)130種單克隆抗體可用。

       2022年，美國或歐盟首次批準的單克隆抗體療法有8種，如表1所示。

       表1. 2022年在歐盟或美國首次獲批的單克隆抗體療法

       通過(guò)工程化抗體的Y形結合位點(diǎn)以同時(shí)識別兩種不同的抗原，可以提高治療效力，這種分子被稱(chēng)為雙特異性抗體（BsAb），起到橋梁的作用，一個(gè)位點(diǎn)與腫瘤特異性抗原結合，另一個(gè)位點(diǎn)與免疫細胞結合以激活宿主免疫反應。

       BsAb在單個(gè)抗體中含有兩個(gè)靶標結合單元，表現出兩種不同的Fab（抗原結合片段）狀態(tài)。它充當具有不同作用模式的兩種抗原之間的橋梁。到目前為止，已經(jīng)生產(chǎn)了一百多種BsAb，并且仍在進(jìn)行廣泛的研究。表2顯示目前被批準的BsAb。

       表2. 已經(jīng)獲批的BsAb

       除此之外，人們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了三特異性抗體，導致治療特異性和效果的進(jìn)一步增強。目前還沒(méi)有獲批的三特異性抗體，但是在研的也有很多。下面詳細介紹一下這些抗體利用哪些細胞進(jìn)行殺傷腫瘤細胞作用。

       雙抗通過(guò)T細胞介導腫瘤殺傷作用

       BiTE是一種具有獨特功能的雙特異性抗體構建體，同時(shí)結合腫瘤細胞上的抗原和T細胞上的表面分子以誘導腫瘤溶解。BiTE是通過(guò)替換兩個(gè)綁定的臂而開(kāi)發(fā)的具有兩個(gè)不同的單鏈可變片段（scFvs），以形成具有柔性甘氨酸-絲氨酸接頭的二體。這種新穎的形式不僅提高了產(chǎn)量，而且還通過(guò)兩者scFvs促進(jìn)了與不同抗原的結合（圖1A）[1]。

       一個(gè)scFv結合B細胞淋巴瘤的生物標志物，例如CD19或B細胞成熟抗原（BCMA），而另一種特異性結合T細胞表面標志物CD3以激活T細胞功能（圖1B）[2]。

       博納吐單抗（Blinatumomab，抗CD3 / CD19）是B細胞前體急性淋巴細胞白血?。ˋLL）的治療方法，是第一個(gè)也是目前為止唯一一個(gè)被批準的BiTE藥物，由兩個(gè)主要片段組成：抗CD3 scFv（VL-VH）和抗CD19 scFv（VL-VH）。接頭主要由小的甘氨酸和絲氨酸殘基組成，并在每個(gè)scFv中連接VL和VH，并連接兩個(gè)scFv（圖1A）。

       圖1. Blinatumomab的結構和作用機制

       靶向BCMA和CD3的BiTE分子AMG420的一項臨床I 期試驗 （NCT02514239）在復發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤患者中實(shí)現了70%的總緩解率，最大耐受劑量（MTD）為400μg每天。除此之外，大多數BiTE的開(kāi)發(fā)仍處于臨床前和早期臨床試驗階段[3]。

       雙抗通過(guò)NK細胞介導腫瘤殺傷作用

       免疫系統通常由兩支手臂組成，即先天性和適應性免疫反應，它們協(xié)同抵御入侵病原體。雖然免疫系統的兩個(gè)臂都包含多種細胞類(lèi)型，但NK細胞被認為是先天免疫反應的組成部分。

       NK細胞在治療中的應用根據癌癥類(lèi)型高度多樣化。迄今為止，相關(guān)的治療劑包括細胞因子補充劑、單克隆抗體和基因工程NK細胞。

       NK細胞接合器（NKCEs）和CAR-NK細胞被設計用來(lái)利用NK細胞介導的細胞毒 性來(lái)對抗腫瘤。NKCE是通過(guò)連接抗NK細胞受體（主要是CD16）和一個(gè)TAA (bispecific killer engagers, BiKEs）或兩個(gè)TAA（trispecific killer engagers, TriKEs）的單鏈抗體來(lái)構建的。到目前為止，抗CD16的BiTEs已經(jīng)被有效地用于針對廣泛的TAA，包括CD19、CD20、CD30、CD33、CD133和EPCAM。

       由于基于抗體的癌癥治療的進(jìn)步，FDA已經(jīng)批準了幾種可以激活NK細胞的mAb，例如阻斷免疫檢查點(diǎn)分子的抗PD-L1單克隆抗體，并且可以顯著(zhù)誘導NK細胞功能破壞腫瘤細胞。

       活化的NK細胞表達CD16受體，也稱(chēng)為Fcγ受體（FcγR）IIIa，其與抗體的Fc區域結合并誘導細胞因子的釋放，包括TNF-α和IFN-γ，導致腫瘤細胞凋亡（圖2）。作為直接介導NK細胞毒 性的裂解受體，CD16與各種抗體的Fc部分結合可以促進(jìn)NK細胞介導的ADCC。CD16有兩種亞型（CD16a和CD16b），具有不同的表達譜和功能[4]。

       與T細胞結合療法相比，NK細胞療法具有更長(cháng)的半衰期（長(cháng)達19小時(shí)），并且病人可以更好地耐受。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出各種雙特異性殺傷細胞結合劑（BiKE），以同時(shí)結合NK細胞和腫瘤細胞上的抗原，從而增強NK細胞的細胞毒 性作用。

       圖2. bsAb介導的先天免疫細胞殺死腫瘤細胞的示意圖

       AFM13是最成功的BiKE之一，是一種雙特異性四價(jià)嵌合抗體構建體，靶向CD16a和CD30，用于治療CD30陽(yáng)性淋巴瘤。

       AFM13結構如圖3所示，全功能T和Ab抗體是通過(guò)組成結構域的免疫球蛋白重鏈（VH）和輕（VL）可變鏈的非共價(jià)相互作用，以頭到尾的方式對單個(gè)多肽進(jìn)行同源二聚化而形成的[5]。

       臨床I期試驗（NCT01221571）結果顯示AFM13是耐受的，安全的，并且對難治性和/或復發(fā)性霍奇金淋巴瘤患者有效。更具體地說(shuō)，在這項劑量遞增研究中，總計28名患者接受AFM13的劑量為0.01至7mg 每千克體重，結果顯示未達到 MTD。26例可評估患者中有3例（11.5%）達到部分緩解，13例（50%）病情穩定，總體疾病控制率為61.5%。

       II期研究（NCT03192202）旨在優(yōu)化AFM13的給藥方案以提高其治療效果正在進(jìn)行中。此外，另外I期研究（NCT04074746）在MD安德森癌癥中心進(jìn)行，旨在檢查AFM13和來(lái)自臍帶血修飾NK細胞組合和AFM13單獨對抗 CD30 陽(yáng)性霍奇金淋巴瘤或復發(fā)性/難治性非霍奇金淋巴瘤的功效。

       另一項評估AFM13在R/R CD30陽(yáng)性T細胞淋巴瘤或轉化型蕈樣真菌?。ㄖ囟ㄏ颍┗颊咧械腎I期研究(NCT04101331)也在進(jìn)行中。

       圖3. AFM13的折疊途徑

       另一個(gè)BiKE結構化合物AF M24是識別人類(lèi)表皮生長(cháng)因子受體（EGFR）改善NK細胞和巨噬細胞對抗EGFR陽(yáng)性腫瘤細胞的毒 性。AF M24單藥治療I期臨床試驗中在晚期實(shí)體惡性腫瘤患者中顯示出有希望的結果。AF M24與SNK01聯(lián)合用于表達EGFR的晚期/轉移性癌癥受試者的安全性、耐受性和抗腫瘤活性的臨床I/II期（NCT05099549）試驗正在招募種。

       另一項臨床II 期試驗 （NCT04259450）來(lái)評估治療多種腫瘤類(lèi)型的總緩解率也在進(jìn)行中。除此之外，還有很多臨床前在研的通過(guò)NK細胞介導腫瘤殺傷作用的雙抗[4]。

       雙抗通過(guò)巨噬細胞介導腫瘤殺傷作用

       整合素相關(guān)蛋白（IAP，即CD47）是一種重要的自我信號，它通過(guò)與巨噬細胞上的配體信號調節蛋白α（SIRPα）結合，進(jìn)而抑制巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬；此外，在天然免疫細胞如樹(shù)突狀細胞等向適應性免疫T細遞呈抗原的過(guò)程中，CD47也發(fā)揮著(zhù)抑制作用。

       而且，一些腫瘤細胞也在其表面表達CD47，如非霍奇金淋巴瘤（NHL），AML，膠質(zhì)母細胞瘤，卵巢癌，乳腺癌和結腸癌，可以幫助它們逃避宿主免疫監視。因此，CD47在腫瘤免疫中發(fā)揮著(zhù)重要的調節作用，靶向CD47是一個(gè)潛在的抗腫瘤方向。

       但是，要注意的是CD47是一種跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，也存在于各種造血細胞，尤其是紅細胞（RBC）和血小板以及非造血細胞，這可能會(huì )限制抗體對實(shí)體瘤的影響。

       輝瑞開(kāi)發(fā)了靶向CD47/PD-L1的雙特異抗體PF-07257876，靶向這兩個(gè)靶點(diǎn)的抗體也是國內開(kāi)發(fā)較多的雙特異抗體。PF-07257876設計中，為了防止CD47對紅細胞等細胞的結合而引起嚴重的副反應，其采用了差異化的結合能力——抗體對PD-L1有高親合力而對CD47有較低的親合力，兩者親合力相差2個(gè)數量級以上（對PD-L1的親合力為0.227 nM，對CD47的親合力為59.5 nM）（圖4）[6]。

       圖4. PF-07257876結構與活性

       同時(shí)為了增加抗體的藥效，該抗體采用IgG1亞型，并且具有ADCP和ADCC等效應。PF-07257876對PD-L1具有更高的親合力，因此使得抗體更多的聚集于腫瘤微環(huán)境中而不是外周血（圖5）。

       圖5. PF-07257876的ADCP和ADCC效應

       PF-07257876的療效目前正在一項I期臨床試驗（NCT04881045）中評估，用于晚期非小細胞肺癌（NSCLC），鱗狀細胞癌或卵巢癌的患者。

       Amivantamab（JNJ-6372）是一種具有免疫細胞導向活性的EGFR-間質(zhì)表皮轉化因子（MET）雙特異性抗體，靶向激活和耐藥EGFR及MET突變及擴增（圖6）。該藥是強生與丹麥Genmab公司合作基于DuoBody平臺研發(fā)針對EGFR第20號外顯子有插入突變的肺癌患者[7]。

       Amivantamab已被批準用于轉移性NSCLC患者（NCT04599712），目前正在參與一項II期臨床試驗（NCT04945733）。

       圖6. Amivantamab的結構

       三特異性抗體通過(guò)T細胞或

       NK細胞介導腫瘤殺傷作用

       最近，三特異性抗體也被積極研究以增強免疫細胞的抗腫瘤活性。三特異性抗體構建介導的免疫細胞殺傷腫瘤細胞的作用機制如圖7所示，包括A. 兩個(gè)通過(guò)T細胞的結合位點(diǎn)CD3和CD28靶向T細胞以及一個(gè)通過(guò)CD38靶向腫瘤細胞；B. 兩個(gè)通過(guò)CD16和IL15R靶向NK細胞和一個(gè)靶向腫瘤細胞的結合位點(diǎn)，如CD33用于白血病治療。

       圖7. 三特異性抗體構建介導的免疫細胞殺傷腫瘤細胞的作用機制

       NM21-1480是一種靶向PD-L1、4-1BB 和人血清白蛋白 （HSA）的三特異性抗體。目前一項NM21-1480成年NSCLC患者的II期臨床試驗（NCT04442126）正在招募。

       Harpoon Therapeutics公司研發(fā)了四種三特異性抗體進(jìn)入臨床試驗[8]包括HPN217（NCT04184050），HPN328（NCT04471727)，HPN424（NCT03577028）和HPN536(NCT03872206)。

       HPN217是一種BCMA靶向T細胞結合雙特異性，含有三種人源化抗體衍生的結合域，包括BCMA（用于多發(fā)性骨髓瘤細胞結合），白蛋白（延長(cháng)半衰期）和CD3（用于 T 細胞接合），治療復發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤（RRMM）。大多數應答者在治療第2周時(shí)sBCMA降低以及在許多達到 ≥VGPR 的應答者中，sBCMA 在 9 個(gè)月時(shí)仍然無(wú)法檢測到（圖8）。

       圖8. HPN217結構與活性

       HPN328 是一種源自 TriTAC? 平臺的DLL3靶向 T 細胞接合劑。HPN328 包含 3 個(gè)結合域，設計用于重定向T細胞以殺死表達DLL3的癌細胞，包括抗DLL3（用于目標參與），抗白蛋白（延長(cháng)半衰期）和抗 CD3（用于 T 細胞接合）。HPN328 與 CD3 和 DLL3 單價(jià)結合，最大限度地減少非特異性 T 細胞活化，在一位61歲患者中開(kāi)始用1.215mg HPN328治療，后來(lái)劑量增加到7.0mg HPN328，看到部分緩解：第 10 周目標病變直徑總和減少 53%（圖9）。

       圖9. HPN328作用機制和活性

       目前三特異性抗體還沒(méi)有獲批上市的產(chǎn)品，大部分都處于早期研發(fā)階段。

       小     結

       抗體藥行業(yè)是近些年發(fā)展十分迅猛的行業(yè)，是當前生物藥中復合增長(cháng)率最高的一類(lèi)藥物，不論是從融資金額，融資數量，獲批藥物數量還是從抗體藥物銷(xiāo)售額都可以看出這個(gè)領(lǐng)域的前景和價(jià)值。

       抗體的研發(fā)也越來(lái)越成熟，不僅開(kāi)發(fā)單克隆抗體，雙特異性抗體，三特異性抗體，也基于抗體開(kāi)發(fā)很多藥物偶聯(lián)物，包括抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）等。

       雙特異性抗體和三特異性抗體可以通過(guò)T細胞，NK細胞和巨噬細胞介導的殺死腫瘤細胞。

       與T細胞結合療法相比，NK細胞療法具有更長(cháng)的半衰期（長(cháng)達19小時(shí)），并且病人可以更好地耐受。而且，BiKE和TriKE還比T細胞接合器具有更低的毒 性和更高的安全性，這意味著(zhù)CRS或非靶向細胞毒 性的風(fēng)險更低，在實(shí)體腫瘤中的應用前景更廣闊。與NKCE類(lèi)似，成熟的NK細胞也可以作為一個(gè)有趣的候選細胞來(lái)表達CARs，對抗豐富的TAA，如CD19、CD20、CD244和HER2。

       References

       1.Yeji Hong, Su?Min Nam, Aree Moon, Antibody–drug conjugates and bispecific antibodies targeting cancers: applications of click chemistry, Archives of Pharmacal Research 2023

       2.Blinatumomab Extends Survival for Patients with Advanced ALL, Cancer Currents Blog

       3.A. Pipeline, https://www.amgenpipeline.com/ (accessed: April, 2022).

       4.Yaping Sun and Jian Xu, Emerging Antibodies in Cancer Therapy, Adv. NanoBiomed Res. 2023, 3, 2200083

       5.Achim Rothe, Stephanie Sasse, Max S Topp, Dennis A Eichenauer, Horst Hummel, Katrin S Reiners, Markus Dietlein, Georg Kuhnert, Joerg Kessler, Carolin Buerkle, Miroslav Ravic, Stefan Knackmuss, Jens-Peter Marschner, Elke Pogge von Strandmann, Peter Borchmann, Andreas Engert, A phase 1 study of the bispecific anti-CD30/CD16A antibody construct AFM13 in patients with relapsed or refractory Hodgkin lymphoma, Blood. 2015 Jun 25;125(26):4024-31.

       6.Shih-Hsun Chen, Pawel K Dominik, Jessica Stanfield, Sheng Ding, Wenjing Yang, Nadia Kurd, Ryan Llewellyn, Jonathan Heyen, Carole Wang, Zea Melton, Thomas Van Blarcom, Kevin C Lindquist, ja vier Chaparro-Riggers, Shahram Salek-Ardakani, Dual checkpoint blockade of CD47 and PD-L1 using an affinity-tuned bispecific antibody maximizes antitumor immunity, J Immunother Cancer. 2021 Oct;9(10):e003464.

       7.Joost Neijssen, Rosa M. F. Cardoso, Kristen M. Chevalier, Luus Wiegman, Thomas Valerius, G. Mark Anderson, Sheri L. Moores, Janine Schuurman, Paul W. H. I. Parren, William R. Strohl, and Mark L. Chiu, Discovery of amivantamab (JNJ-61186372), a bispecific antibody targeting EGFR and MET, J. Biol. Chem. (2021) 296 100641

       8.Https://www.harpoontx.com