導語(yǔ)

       目前，各種測序技術(shù)已經(jīng)成為了藥物研發(fā)過(guò)程中的得力工具。單細胞轉錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），簡(jiǎn)單從字面理解，就是一種在單細胞水平上對轉錄組進(jìn)行測序分析的技術(shù)。目前，這項技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛地應用，并在應用中不斷地快速發(fā)展，成為我們研究細胞類(lèi)別、疾病發(fā)生過(guò)程等問(wèn)題的有力工具。

       PART. 01

       為什么要用scRNA-seq？

       傳統的批量測序（bulk RNA sequencing）有一個(gè)繞不過(guò)的難題：細胞的異質(zhì)性。

       眾所周知，對于多細胞生物來(lái)說(shuō)，盡管由同一個(gè)受精卵發(fā)育而來(lái)，但不同細胞之間的基因表達必然是有差異的，這些差異導致了細胞的分化，使不同的細胞承擔不同的生理功能。粗糙地看，不同器官、組織的細胞組成不同，但使分析變得棘手的問(wèn)題在于，即使是在形態(tài)上無(wú)法區分的細胞之間基因表達水平和對刺激的反應方面也存在很大的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性在組織生物學(xué)和疾病的發(fā)展中起著(zhù)重要作用，例如病原體細胞或癌細胞之間的表達異質(zhì)性可能與人類(lèi)疾病有關(guān)，在進(jìn)行藥物研發(fā)時(shí)，細胞的異質(zhì)性也往往造成靶點(diǎn)難尋、耐藥性等問(wèn)題。

       圖1. 腫瘤異質(zhì)性(Nature 2013 Vol. 501 Issue 7467 Pages 338-345)

       在使用多細胞水平的分析時(shí)，每個(gè)細胞的異質(zhì)信息很容易被掩蓋在多個(gè)細胞的平均信息中。比如大家非常熟悉的Western blot。當我們使用Western blot檢測蛋白質(zhì)的含量時(shí)，我們無(wú)法區分目標蛋白是在10%的細胞中強表達，還是在50%的細胞里中等表達，還是在所有細胞中弱表達。但如果使用流式細胞術(shù)，我們就可以清晰地區分上述情況。

       圖2. Western blot VS 流式細胞術(shù)(https://zhuanlan.zhihu.com/p/28844468)

       單細胞轉錄組測序也是一樣的道理。當使用bulk RNA-seq時(shí)，每個(gè)細胞的轉錄組差異同樣會(huì )被多個(gè)細胞的平均信息所掩蓋，而如果在單細胞水平對每個(gè)細胞進(jìn)行分析，我們就可以得到異質(zhì)性信息，進(jìn)而可以對細胞進(jìn)行更準確地分群、發(fā)現新的細胞種類(lèi)、研究隨機基因的表達，以及對細胞譜系路徑進(jìn)行探索。為藥物研發(fā)提供更準確的信息，開(kāi)辟新的路徑，實(shí)現真正的“對癥下藥”。

       圖3. 單細胞測量保存了大量基因組分析丟失的關(guān)鍵信息(Genome Research 2015 Vol. 25 Issue 10 Pages 1491-1498)

       自從2009年由湯富酬等人開(kāi)發(fā)出第一種單細胞轉錄組測序技術(shù)，到今天已經(jīng)有幾十種不同的單細胞轉錄組測序技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，它們各自有不同的優(yōu)勢與缺點(diǎn)，我們可以在了解不同技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)之后，選擇最適合自己的研究的技術(shù)。

       圖4. scRNA-seq發(fā)展史

       圖5. 部分常用的scRNA-seq(Chen, G., et al. (2019). "Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis." Frontiers in Genetics 10(317).)

       PART. 02

       單細胞RNA測序技術(shù)原理

       單細胞測序基本流程通常分為以下幾個(gè)部分：?jiǎn)渭毎蛛x、基因擴增、構建信息庫、高通量測序、數據分析。單細胞分離技術(shù)分類(lèi)眾多，單細胞分離溶解后獲得pg級的核酸，通過(guò)擴增至ng或μg級，然后用于后續的測序。目前常用單細胞分離方法有有限稀釋法、顯微操作（手工細胞采集）、激光捕獲顯微切割、熒光活化細胞分選、磁活化細胞分選、微流體技術(shù)等。

       圖6. 單細胞測序流程 (李勃,朵泓睿.單細胞RNA測序數據分析方法研究進(jìn)展[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2021,38(05):129-135+142.)

       目前單細胞RNA測序常用技術(shù)有Tang RNA-seq、Smart-seq、Smart-seq 2、CEL-seq、Quartz-seq、STRT-seq、Drop-seq等，而利用這些技術(shù)構建的被大規模使用的測序平臺有10xGenomics平臺、Illumina®Bio-Rad® 平臺、BD Rhapsody™ 平臺、ICELL8 平臺和C1™ 單細胞全自動(dòng)制備系統等等。接下來(lái)以10xGenomics平臺為代表具體介紹單細胞RNA測序過(guò)程中基因擴增與信息庫構建的具體過(guò)程。

       10xGenomics

       10×Genomics平臺基于微滴的核酸條形碼分配系統，該系統提供了數以百萬(wàn)計級的攜帶唯一DNA條形碼的微滴，通過(guò)微流控技術(shù)，首先將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個(gè)細胞包裹在油滴（GEMs）中。凝膠珠溶解，細胞裂解釋放mRNA，通過(guò)逆轉錄產(chǎn)生用于測序的帶條形碼和UMI信息的cDNA。液滴油層破碎，cDNA擴增，制備cDNA文庫，然后使用Illumina測序平臺對文庫進(jìn)行測序檢測，即可獲得大量單細胞的基因表達和免疫組庫數據。

       圖7. 10xGenomics平臺流程圖 (https://zhuanlan.zhihu.com/p/269461589)

       10xGenomics技術(shù)的核心是油滴包裹的凝膠珠（GEMs）。GEM（10X Genomics Gel in Emulsion）是一個(gè)由 mRNA、磁珠、乳液組成的液滴狀反應系統，后續的細胞分選、反轉錄的反應都是在這個(gè)液滴反應系統中進(jìn)行。GEMs 的結構確保了＞90% 的油滴內反應產(chǎn)物都可以順利用唯一的 barcode 分子標記。Gel bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構成。Gel bead上連接的引物序列包含四個(gè)部分：Illumina TruSeq Read 1測序引物、16 nt的條形碼（Barcode）、12 nt的UMI和30 nt的Poly(dT)反轉錄引物

       圖8. GEM示意圖（左），Gel bead示意圖（右）

       具體流程是先將樣本制備成單細胞懸浮液，細胞質(zhì)檢然后進(jìn)行細胞計數和細胞活性測定，最終使細胞活性高于90%，細胞濃度為700～1200個(gè)細胞/μL。

       取75μL Master Mix＋細胞懸浮液、40μL的含有barcode信息的凝膠珠和280μL的油滴分別加入到Chromium Chip B的不同小室，經(jīng)由微流體“雙十字”交叉系統形成油滴包裹的凝膠珠（Gel Bead-In- EMulsions，GEMs）。有效的GEMs包含凝膠珠、單細胞、Master Mix和油。

       收集GEMs，并將其全部混合，凝膠珠在每個(gè)油滴內自動(dòng)溶解釋放大量Barcode引物序列，細胞裂解釋放mRNA，mRNA與逆轉錄酶、凝膠珠上的poly dT反轉錄引物以及dNTP底物相接觸，在逆轉錄酶的作用下發(fā)生逆轉錄反應，產(chǎn)生用于測序的帶有Barcode和UMI信息的cDNA一鏈，再以SMART擴增方法完成第二鏈合成。

       cNDA片段化油滴破碎，磁珠純化cDNA一鏈，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。

       cDNA擴增完成后，首先利用化學(xué)方法將cDNA打斷成200- 300bp左右的片段，通過(guò)末端修復、加A進(jìn)行cDNA片段篩選，P7 adaptor接頭連接Read2測序引物，并通過(guò)PCR擴引入樣品Index，最后進(jìn)行片段篩選，從而構建含有P5和P7接頭的cDNA文庫。

       文庫完成以后，進(jìn)行庫檢，cDNA文庫庫檢合格后，直接在Illumina的測序儀上進(jìn)行測序。測序完成之后，進(jìn)行數據分析。

       數據分析

       單細胞RNA測序得到的數據通常從這幾個(gè)方面展開(kāi)進(jìn)行：1、序列比對和表達水平量化；2、數據預處理；3、數據標準化；4、高變異基因的選擇和降維分析；5、聚類(lèi)分析；6、細胞類(lèi)型注釋?zhuān)?、差異表達的鑒定及富集分析；8、進(jìn)階分析：如細胞譜系追蹤、生物網(wǎng)絡(luò )構建、空間轉錄組等。

       圖9. scRNA-seq的數據分析(李勃,朵泓睿.單細胞RNA測序數據分析方法研究進(jìn)展[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2021,38(05):129-135+142.)

       PART. 03

       單細胞測序的優(yōu)缺點(diǎn)與

       現在一些主流技術(shù)之對比

       單細胞測序的第一個(gè)缺陷是樣本制備和建庫成本更高，數據量更大，更加復雜，需要更多時(shí)間、設備、容量來(lái)進(jìn)行該項工作。

       單細胞測序第二個(gè)缺陷是跨細胞的生物學(xué)誤差，是因為樣品細胞之間存在一些生物學(xué)變異，主要包括：

       1、轉錄脈沖，它指的是并不是所有基因的基因轉錄都處于啟動(dòng)階段，主要由捕獲時(shí)間來(lái)確定這些基因是打開(kāi)還是關(guān)閉狀態(tài)；

       2、然后是每條RNA加工速度都不相同；

       3、環(huán)境刺激也會(huì )影響基因的表達；

       4、時(shí)序改變，指的是像細胞周期這樣的細胞時(shí)序變化過(guò)程，會(huì )影響單個(gè)細胞的基因表達譜。

       單細胞測序的第三個(gè)缺陷是樣品之間的技術(shù)差異，主要包括：

       1、細胞特異性捕獲效率不同，不同細胞捕獲轉錄本不同，導致測序深度不同；

       2、文庫質(zhì)量：獲得的樣品中會(huì )存在降解的RNA、低存活力細胞、大量自由漂浮的RNA以及細胞定量不準確，這些導致質(zhì)量指標降低；

       3、擴增偏差：在文庫制備的擴增步驟中，并非所有轉錄本都擴增到相同水平；

       4、批次效應：可以從圖中看到因為批次不同造成細胞表達顯著(zhù)性差異，這就要求在實(shí)驗中最好在同一天、同一個(gè)人在同一個(gè)地點(diǎn)完成所有RNA分離及建庫工作來(lái)盡量避免批次效應。

       當前單細胞測序用到的兩種主流技術(shù)主要為10x Genomics和smart-seq，他們有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

       首先是smart-seq 的大致步驟：細胞制成單細胞懸液、帶poly（A）尾的RNA逆轉錄、模版轉換、cDNA的擴增、cDNA片段化、加入文庫PCR引物進(jìn)行擴增、測序。

       它的優(yōu)點(diǎn)主要在于相對于截短的cDNAs，該技術(shù)所采用的M-MLV逆轉錄酶更傾向于選擇全長(cháng)cDNAs作為其末端轉移酶活性的底物。因此它的測序深度大大增加，基本每個(gè)轉錄本的所有外顯子都能被檢測到，這使它可以用于檢測可變剪接，還可以在轉錄本層面進(jìn)行全面的突變分析，擴大了其應用范圍。

       此外它的優(yōu)點(diǎn)還包括：

       1、進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)后，Smart-seq2利用現成的試劑能生產(chǎn)更高質(zhì)量的文庫，且成本也有所下降，為分析大量細胞提供了可能性。

       2、Smart-seq2的方案組分和原理是公開(kāi)的，讓研究人員可以進(jìn)一步對其進(jìn)行改良，目前在這個(gè)方案基礎上涌現了許多單細胞測序的新成果。

       它的缺陷是：建庫過(guò)程依賴(lài)于孔板，這使得它們難以達到很高的通量，smart-seq是基于96孔板的，那么同批次只能測96個(gè)細胞。

       Microwell 通過(guò)縮小孔體積來(lái)增加細胞數量，但依然受到限制。

       它的另一個(gè)缺陷是因為引物的設計，只能選擇性識別聚腺苷酸化的RNA，所以不能分析沒(méi)有poly（A）的RNA。

       接下來(lái)是10x Genomics，它是依賴(lài)于液滴的，大致步驟就是通過(guò)微流控技術(shù)將單個(gè)細胞和一個(gè)捕獲RNA的微珠包裹在液滴中，微珠連接的捕獲mRNa上已經(jīng)預先包含UMI和細胞條形碼信息，讓每個(gè)液滴帶上獨特信息，在液滴中完成mRNA的富集后將微珠合并，完成測序。

       它的優(yōu)點(diǎn)在于：

       1、在該方法中，含有細胞的油滴占所有油滴比例大約5%，這樣能夠更好地保證了含細胞的液滴中只含有一個(gè)細胞。

       2、每個(gè)液滴中均含有獨特的細胞條形碼和UMI，能夠區分單細胞。

       3、而且它不受限于孔板，可以短時(shí)間內同批次處理更多的細胞。

       它的缺陷在于：

       1、微珠對mRNA的捕獲效率有限，在獲得細胞數量的突破的同時(shí)，能夠測得的細胞基因數較少，就是測序深度比較低。

       2、而且該技術(shù)測序多為3‘端測序，測得的序列相同性很高，靈敏度和準確度都不及全場(chǎng)測序。

       PART. 04

       結語(yǔ)

       scRNA-seq為異質(zhì)性問(wèn)題的解決提供轉錄組水平的解決方法，自這項技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，它就在飛速發(fā)展的同時(shí)得到了廣泛的應用，從基因表達到細胞分群，再到譜系分析，scRNA-seq將這些點(diǎn)連成線(xiàn)，為今天的藥物研發(fā)提供了更多的方向。scRNA-seq在今天大放異彩，在未來(lái)的表現也同樣令人期待。

       關(guān)于筆者

       尋藥真理團

       他們是南京大學(xué)新藥研發(fā)策略課程的學(xué)生，本篇為該課程中杜軼翔、徐倩、徐思瓊、李飛4名同學(xué)共同完成。

       他們朝氣蓬勃、他們斗志昂揚，他們腳踏實(shí)地學(xué)習新藥研發(fā)知識，他們堅信吾愛(ài)吾師吾更愛(ài)真理。

       他們是新一代醫藥行業(yè)接班人，他們是新藥研發(fā)領(lǐng)域的未來(lái)之光！

       參考文獻：

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       [10] https://zhuanlan.zhihu.com/p/269461589

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