01
簡(jiǎn)介
COVID-19的大流行把mRNA**推向整個(gè)生物藥行業(yè)的C位，ioNTech/ Pfizer，Moderna已經(jīng)上市，在歐美廣泛接種。值得注意的是二者的遞送系統均為脂質(zhì)納米顆粒。**開(kāi)發(fā)的速度也超出了預期，這些結果僅在SARS-CoV-2序列公開(kāi)發(fā)布后10個(gè)月才出現。
與其他藥物形式（包括小分子，DNA，寡核苷酸，病毒系統和蛋白質(zhì)，包括抗體）相比，mRNA治療劑具有許多優(yōu)勢和若干挑戰。與DNA相比，mRNA僅需要進(jìn)入細胞質(zhì)核糖體翻譯，而無(wú)需進(jìn)入細胞核，因此不存在基因組整合的風(fēng)險。與蛋白質(zhì)和病毒系統相比，mRNA的生產(chǎn)過(guò)程無(wú)細胞，速度更快，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有天然的糖基化和構象特性。當與脂質(zhì)納米顆粒（LNP）輸送系統結合使用時(shí)。
02
技術(shù)平臺開(kāi)發(fā)中的主要挑戰因素
自身的免疫原性、對酶促降解的敏感性導致不穩定、裸mRNA難以被細胞攝取。mRNA的固有免疫原性歸因于細胞通過(guò)Toll樣受體（TLR），激活免疫系統，盡管這種激活可能有助于增強對mRNA**的免疫反應，但直接的作用是通過(guò)eIF2a的PKR磷酸化來(lái)下調翻譯，這削弱了eIF2的活性，抑制了mRNA的翻譯，從而抑制了對蛋白質(zhì)合成。消除這種先天免疫應答的主要方法是在序列中使用例如1-methylpseudouridine和其他存在tRNA和rRNA中的不常見(jiàn)的核苷酸而不是常見(jiàn)的核苷酸，是的固有免疫系統對他們不敏感。這種修飾技術(shù)已經(jīng)在在BioNTech / Pfizer和Moderna SARS-CoV-2**中使用，并且在臨床試驗中顯示出> 94％的有效效。另一種方式是CureVac所采用的：通過(guò)密碼子優(yōu)化和盡量不使用鳥(niǎo)苷酸，因為T(mén)LR7和TLR8主要識別富含GU的單鏈RNA序列。
mRNA治療的第二個(gè)挑戰是其對核酸酶的敏感性，例如血清中半衰期小于5分鐘。盡管siRNA的化學(xué)修飾在提高穩定性和降低免疫原性方面非常成功，但迄今為止，由于翻譯機制對這些修飾的敏感性 ，它們尚未成功用于mRNA修飾。
mRNA的第三個(gè)挑戰是除未成熟的樹(shù)突狀細胞外，大多數細胞類(lèi)型中缺乏裸露的mRNA的細胞攝取能力。通過(guò)合適的遞送系統攜帶mRNA可以解決這最后兩個(gè)挑戰，既可以保護mRNA不受酶的攻擊，又可以促進(jìn)細胞的攝取。比如，在動(dòng)物模型中使用脂質(zhì)納米顆粒載體系統與nakedmRNA相比，mRNA的表達效率可以提高1000倍。
03
遞送系統
這些臨床試驗中的所有mRNA遞送系統都是脂質(zhì)納米顆粒，輝瑞-BioNTech LNP和Moderna LNP的確切組成已公開(kāi)披露，而其他一些則沒(méi)有，其他的都最有可能類(lèi)似于A(yíng)lnylam Onpattro™產(chǎn)品。
04
脂質(zhì)納米顆粒的組裝和結構
目前，mRNA脂質(zhì)納米顆粒的生產(chǎn)方法利用微流體或T型接頭混合，將含有疏水性脂質(zhì)的乙醇相和含有mRNA的水相快速混合在pH值為4的緩沖液（如乙酸）中。微流體混合的優(yōu)勢在于能夠將乙醇中的極少量脂質(zhì)與水溶液中的mRNA（數十微升）混合，從而可以篩選許多組分和配方參數。
另一方面，T-mixing是商業(yè)生產(chǎn)大批mRNA LNP（例如當前臨床試驗中的LNP）的通用選擇方法。最近的文獻證明這兩種方法均可以生產(chǎn)大小和形態(tài)相似的LNP顆粒，將最終生產(chǎn)的顆粒尺寸限制為<100 nm，其中兩種溶液的快速混合是關(guān)鍵。由這些溶液組裝和形成LNP的過(guò)程是由疏水力和靜電力共同驅動(dòng)的。四種脂質(zhì)（可電離脂質(zhì)，DSPC，膽固醇，PEG-脂質(zhì)）最初可溶于乙醇，而沒(méi)有其他可中和的離子，因此可電離的脂質(zhì)為非質(zhì)子化且電中性。通常將一體積的含脂質(zhì)的乙醇溶液與三體積的mRNA在pH = 4的醋酸鹽緩沖液中混合，這樣，當脂質(zhì)與含水緩沖液接觸時(shí)，它們變得不溶于3：1的水/乙醇溶劑和可電離的脂質(zhì)變成質(zhì)子化并帶正電荷，然后驅使它與mRNA的帶負電荷的磷酸骨架靜電結合，形成包裹mRNA的脂質(zhì)顆粒并在水溶液中懸浮液中。
該過(guò)程中的關(guān)鍵成分是PEG-脂質(zhì)，因為PEG鏈是親水性的，因此可以包覆顆粒，并決定其最終的熱力學(xué)穩定尺寸。通過(guò)改變PEG的摩爾分數，可控制LNP的大小，例如100 nm顆粒時(shí)PEG-脂質(zhì)為0.5％摩爾分數，43 nm 顆粒粒徑事PEG-脂質(zhì)為3％摩爾分數。
最近一項重要數據顯示，當將mRNA LNP懸浮液在水性緩沖液中稀釋或在水性緩沖液中透析以提高pH值并消除乙醇時(shí)，LNP的結構和大小在混合后仍在繼續變化。水相和脂質(zhì)相的初始混合產(chǎn)生的pH值接近5.5，使可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，其LNP pKa值接近6.5，并促使mRNA結合和封裝。隨后通過(guò)稀釋、透析或切向流過(guò)濾提高pH值，可中和可電離的脂質(zhì)，當可電離脂質(zhì)變?yōu)橹行詴r(shí)，它的溶解度也降低，導致形成較大的疏水性脂質(zhì)結構域，從而驅動(dòng)LNP的融合過(guò)程，從而增大其尺寸，LNP的核心變成非晶態(tài)的電子致密相，主要是含有與mRNA結合的可電離脂質(zhì)。據估計，在此過(guò)程中，多達36個(gè)囊泡可融合形成僅一個(gè)最終的LNP。這項研究以及另一項使用中子散射方法的研究也表明，DSPC在LNP外圍PEG層的下方形成一個(gè)雙層，其中心核心主要是與mRNA結合的可電離脂質(zhì)。
05
遞送系統性能的決定因素
mRNA傳遞系統的性能決定因素是多因素的且相互作用的，包括：（1）它們傳遞至合適細胞并有效釋放mRNA到細胞質(zhì)進(jìn)行翻譯的效率；（2）佐劑，可增強免疫反應，已知脂質(zhì)納米顆粒具有其自身的佐劑活性；（3）將注射部位過(guò)度炎癥或全身分布和脫靶表達可能引起的不良事件或**的影響降至最低。4）劑量：在SARS-CoV-2臨床試驗中，目前正在追求的大劑量劑量最容易理解mRNA遞送系統的效力，從1到100 μg。人體試驗中的劑量明顯分為高劑量的核苷修飾RNA（Moderna，BioNTech）30–100 μg，未修飾的RNA（CureVac，Translate Bio）較低的7.5–20 μg，甚至低劑量的10–10 μg；5）LNP最常引用的決定其效價(jià)或遞送效率的特征是其pKa。pKa是LNP中50％的可電離脂質(zhì)質(zhì)子化的pH。一個(gè)很好的解釋這種pKa依賴(lài)性的模型是基于LNP中的可電離脂質(zhì)在pH 7.4時(shí)接近中性，而在內化進(jìn)入細胞后，內體的pH值隨著(zhù)通過(guò)內溶酶體途徑的發(fā)展而開(kāi)始下降。使可離子化的脂質(zhì)質(zhì)子化，然后將其與內體的陰離子內源性磷脂結合并破壞其雙層結構，從而將mRNA釋放到細胞質(zhì)中通過(guò)核糖體進(jìn)行翻譯。
06
結論
在過(guò)去的二十年中，mRNA治療技術(shù)取得了非凡的進(jìn)展，首先是確定了使用修飾的核苷和序列工程技術(shù)來(lái)控制mRNA固有免疫原性的方法，以及在**和其他治療適應癥中應用mRNA的方法。與以前的系統相比，采用siRNA傳遞中使用的脂質(zhì)納米顆粒原型導致傳遞效率提高了一個(gè)數量級，并且仍在不斷提高，這主要歸功于新型可電離脂質(zhì)的設計。mRNA LNP結構、功能、效價(jià)、靶向性和生物學(xué)特征（如佐劑性）的許多方面仍有待探索，以便充分利用這種強大的轉化治療方式的潛力。
參考文獻：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7836001/， Nanomaterial Delivery Systems for mRNA Vaccines.
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