如何提高移植物和移植受者的長(cháng)期存活率是移植學(xué)研究的主題，其中，對于免疫抑制劑的研究占據著(zhù)重要的地位，而免疫抑制劑一面是其抗排斥反應療效，另一面則是其不良反應。免疫抑制劑能抑制與免疫反應相關(guān)細胞（主要是T細胞和B細胞）的增殖和功能，降低免疫應答。由于各種免疫抑制劑的作用機制不同且其不良反應的程度多與使用劑量有關(guān)，因此，針對移植排斥反應發(fā)生的不同靶點(diǎn)和關(guān)鍵步驟常采用多種免疫抑制劑聯(lián)合的方案，這樣既可協(xié)同增強免疫抑制效果，又可降低各種免疫抑制劑的劑量和不良反應的發(fā)生率。

       APC 為抗原提呈細胞；IL為白細胞介素；TCR為T(mén)細胞受體；JAK為Janus激酶；PI3K為磷脂酰肌醇-3-激酶；mTOR為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；CN為鈣調磷酸酶；MAP激酶為有絲分裂原活化蛋白激酶；IKK為核因子-κB激酶抑制劑；NFAT為活化T細胞核因子；AP-1為激活蛋白因子；CKD/cyclins 為周期蛋白依賴(lài)激酶；IMPDH為次黃嘌呤核苷酸脫氫酶。

       近十年來(lái)，Treg細胞療法在一系列與移植相關(guān)和非移植相關(guān)的適應癥上進(jìn)行了臨床試驗。雖然這些試驗都集中在安全性上，但所有試驗的一個(gè)核心主題是GMP方案在細胞分離、操作、擴增、劑量、特異性和給藥后細胞跟蹤方面的異質(zhì)性。目前Treg在標準化方面達成了一些共識，但現實(shí)是Treg細胞的新穎性要求進(jìn)行大量的人體研究和專(zhuān)注于GMP條件的優(yōu)化和標準化。部分研究更多的想要制造更純的細胞，這種想法基于供體反應特異性TREG比多克隆TREG能更好的治療移植效應T細胞反應。在人類(lèi)中闡明和利用這一機制是很重要的，因為產(chǎn)物純度和同種異體抗原特異性的程度可能會(huì )對治療效果和輸注細胞數量產(chǎn)生影響。腎 臟的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是活體供者有更大的后勤保障范圍，這就提供了連續獲取新鮮供者抗原的途徑，從而提供了供者特異性的Treg細胞。

       01、Treg分類(lèi)

       由于慢性同種異體移植功能障礙和免疫抑制的長(cháng)期副作用尚未完全解決，移植耐受仍然是器官移植領(lǐng)域的圣杯。在這一點(diǎn)上，外周循環(huán)和移植物微環(huán)境中調節性T細胞(Treg細胞)的增加被認為是誘導移植物耐受的重要因素。

       人和鼠的多克隆Treg細胞被經(jīng)典地分為胸腺Treg細胞(tTreg)、外周Treg細胞(pTreg)和誘導型Treg細胞(iTreg)三大類(lèi)，一些學(xué)者通過(guò)tTreg細胞上Helios和Neuropilin-1(NRP-1)的高表達來(lái)區分tTreg細胞和pTreg細胞。然而，Helios/NRP-1本身不能對人類(lèi)的tTregs和pTreg細胞進(jìn)行分類(lèi)。

       外周循環(huán)中Treg細胞的特征是CD4+，高水平的IL-2受體α鏈(CD25high)，低水平的CD127和細胞內表達叉頭盒P3轉錄因子(FOXP3+)。新的深層免疫表型技術(shù)的采用證實(shí)了這種表型比最初認為的更具異質(zhì)性，這些數據因Treg細胞的種類(lèi)、類(lèi)型、分化狀態(tài)和微環(huán)境的不同而不同。進(jìn)一步的區分是通過(guò)鑒定趨化因子受體。

       02、目前研究報道的Treg細胞的特別性質(zhì)

       A:Treg細胞的可塑性

       Treg細胞在炎性微環(huán)境中采用Th17樣效應細胞表型和功能的可能性是一個(gè)關(guān)鍵的安全問(wèn)題。這是因為T(mén)h17細胞在急性和慢性同種異體移植排斥反應患者中升高，因此可能導致這兩種情況的惡化。另一種與Treg-Th17相互作用有關(guān)的途徑是，兩者最初都起源于Naive CD4+細胞，但其隨后的分化途徑分別由微環(huán)境中不含IL-6的轉化生長(cháng)因子-β(針對Treg)或與IL-6(針對Th17)的存在所決定。微環(huán)境將Treg細胞轉化為促進(jìn)排斥反應的Th17細胞的潛力可能決定了輸注Treg細胞的時(shí)間點(diǎn)。理論上，Treg細胞治療可以是主動(dòng)的(即在患者發(fā)生排斥反應之前)，也可以是反應性的(即給予診斷為急性或慢性排斥的患者)。然而，目前尚不清楚Treg細胞能否在已經(jīng)被Teffs滲透的微環(huán)境中誘導耐受。

       B: 旁觀(guān)者壓制效應

       Treg細胞治療可能會(huì )出現一個(gè)潛在的問(wèn)題，因為T(mén)reg細胞一旦被激活，就可以以一種非抗原特異性的方式執行它們的抑制功能。這種被稱(chēng)為“旁觀(guān)者抑制”的效應是在轉基因小鼠模型中發(fā)現的，在轉基因小鼠模型中，抗原特異性的CD4+CD25+T細胞最初需要與TCR介導的互補表位接觸才能激活。然而，一旦激活，這些細胞也能夠抑制第三方抗原特異性的效應CD4+T細胞。這一效應在同種異體皮膚移植的小鼠體內模型中也得到了證實(shí)。如果這一現象確實(shí)在我們的患者中重復出現，可能會(huì )對調節抗原特異性排斥反應，同時(shí)保持對病原體和潛在腫瘤新表位的免疫力產(chǎn)生影響。

       03、TREG代表性試驗

       A. TRACT試驗

       試驗招募9人，細胞分離采用Clinimacs系統，3周擴增過(guò)程中采用抗CD3/CD28拮抗劑、IL-2、TGF-β、西羅莫司。最后得到純度>98% CD4+CD25+和>80% FOXP3+以及相似的去甲基化水平?；颊咴谝浦伯斕旌托g(shù)后第2天接受alemtuzumab治療，并維持使用MMF和他克莫司(第30天改用西羅莫司)。Treg細胞隨后在第60天被輸注。在報告的兩年中，沒(méi)有巨細胞病毒或多瘤病毒引起的機會(huì )性感染病例，也沒(méi)有發(fā)生排斥反應。這項試驗沒(méi)有報道在接受新腎移植的患者輸注多克隆Treg細胞后發(fā)生機會(huì )性感染或排斥反應的病例。

       B. TASK試驗

       相比之下，TASK試驗集中在利用多克隆Treg細胞來(lái)調節移植腎的亞臨床炎癥。這是一個(gè)重要的研究問(wèn)題，因為亞臨床炎癥由于其慢性低級別的性質(zhì)而沒(méi)有得到及時(shí)的診斷，并可能導致遲發(fā)性同種異體移植物功能障礙。

       患者接受體外擴增的自體Treg細胞，平均劑量為320*106個(gè)細胞。2周擴增：抗CD3/CD28拮抗劑，IL-2，重氫葡萄糖處理。最終得到純度>97%CD4+和>93% FOXP3+和<0.37% CD8+的產(chǎn)品。

       試驗招募了三名患者，他們在移植后6個(gè)月的活組織檢查中表現出這種炎癥(Banff i-和t-<2)。當患者獲得Treg細胞時(shí)，他們已經(jīng)在服用MMF、他克莫司和強的松龍。重要的是，從安全性的角度來(lái)看，試驗報告說(shuō)， Treg產(chǎn)品沒(méi)有直接導致SAE，在一年的隨訪(fǎng)期內也沒(méi)有報告感染或移植物功能障礙。然而，當前試驗的一個(gè)關(guān)鍵限制是，與另外一個(gè)試驗中超過(guò)12個(gè)月的檢測不到的情況相比，氘信號在3個(gè)月內無(wú)法檢測到。這就否定了這種技術(shù)的長(cháng)期使用。在輸注后2周和6個(gè)月的腎活檢中，還沒(méi)有發(fā)現這些Treg細胞的報道。因此，目前還不清楚脫氫Treg細胞的產(chǎn)物是否能夠遷移到移植物中。補充這一事實(shí)的是，在輸注后2周，沒(méi)有患者在腎活檢組織中顯示FOXP3+%的表達增加，只有1例患者在6個(gè)月時(shí)出現這種情況。此外，盡管這項技術(shù)有助于短期追蹤，但它并不提供有關(guān)活體Treg功能的知識?？偠灾?，在腎移植中，在輸注FACS分離和多克隆擴增的德化Treg細胞后，沒(méi)有出現SAE。TASK試驗目前正在比較多克隆和同種異體抗原特異性Treg細胞的療效(NCT02711826)。

       C. ONE試驗（德國）

       ONE試驗是評估腎移植后通過(guò)輸注自體自然調節T細胞(nTreg)來(lái)重塑患者的免疫平衡是否安全、可行，并使終生大劑量免疫抑制(其療效有限、不良反應、高直接和間接成本)逐漸減少，同時(shí)在有用的概念驗證疾病模型中解決nTreg治療的幾個(gè)關(guān)鍵挑戰，例如簡(jiǎn)單可靠的制造、過(guò)度免疫抑制的危險、與標準護理藥物的相互作用以及炎癥環(huán)境中的功能穩定性。

       參與者：活體供腎移植受者(ONEnTreg13，n=11)和相應的參照組試驗(ONErgt11-CHA，n=9)。

       干預方式：CD4+CD25+FoxP3+nTreg產(chǎn)品在腎移植后7天靜脈注射0.5、1.0或2.5-3.0×106細胞/kg體重，隨后逐步減少三重免疫抑制至小劑量他克莫司單藥治療，直至48周。

       結果測量：主要臨床和安全終點(diǎn)在第60周由一個(gè)綜合終點(diǎn)進(jìn)行評估，并進(jìn)行進(jìn)一步的三年隨訪(fǎng)。評估包括活檢證實(shí)的急性排斥反應的發(fā)生率，對注射nTreg相關(guān)不良反應的評估，以及過(guò)度免疫抑制的跡象。次要終點(diǎn)包括同種異體移植的功能、全面的探索性生物標志物組合等。

       對于所有患者來(lái)說(shuō)，在腎移植前兩周采集40-50毫升的外周血液就可以生產(chǎn)出產(chǎn)量、純度和功能性都足夠高的nTreg產(chǎn)品。三個(gè)nTreg劑量遞增組均無(wú)劑量限制性**。nTreg組和參照組的同種異體移植物三年存活率為100%，臨床和安全性特征相似。在接受nTregs治療的11名患者中，有8名(73%)獲得了穩定的單藥免疫抑制，而對照組仍在接受標準的二聯(lián)或三聯(lián)藥物免疫抑制(P=0.002)。

       在這個(gè)試驗中第一：沒(méi)有任何炎癥反應跡象。第二：沒(méi)有看到任何過(guò)度免疫抑制的臨床感染現象，這之前是假定的安全性問(wèn)題。作者認為，在沒(méi)有T細胞受體或CD28刺激的情況下，Treg細胞在幾天內失去激活，甚至死亡。因此，只有經(jīng)過(guò)反復抗原刺激的Treg克隆才能保持其抑制能力，并能在體內擴張。第三，作者觀(guān)察到輸注的Treg產(chǎn)物的多克隆T細胞受體在體內隨著(zhù)時(shí)間的推移而轉變?yōu)楣芽寺∧Ｊ?，這表明了同種異體抗原驅動(dòng)的選擇過(guò)程。同樣，在體外用同種異體抗原替代抗CD3/28的多克隆抗體，在幾天內就會(huì )產(chǎn)生一個(gè)偏向的T細胞受體譜系，這表明即使在注射多克隆nTregs之后，也有特異性的免疫調節作用。第四，注射nTreg僅導致Treg計數暫時(shí)增加。四周后循環(huán)Tregs減少的原因可能是nTregs集中于發(fā)炎的移植物或缺乏持久的植入物。最后，nTreg組表達了較少的常規T細胞激活，自然殺傷細胞成熟，這可能表明nTreg在體內的作用方式。需要強調的是這個(gè)試驗中有數據表明nTregs聯(lián)合小劑量他克莫司單一療法不能充分控制先前存在的致病記憶或效應免疫細胞。這一假說(shuō)應該在后續研究中仔細研究。

       04、Treg療法總結

       目前有兩種主要的方法制造Treg細胞：在體內擴增Treg細胞和在GMP條件下體外擴增Treg細胞。大多數中心都專(zhuān)注于Treg的體外擴增，比較這兩種方法的數據對于確定臨床上利用Tregs的最佳方法至關(guān)重要。此外關(guān)于Treg異質(zhì)性的討論將有助于臨床安全方案的開(kāi)發(fā)。

       未來(lái)的另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題將是Treg細胞治療試驗中的免疫抑制管理。根據移植中心的方案，不同的患者目前接受不同的免疫抑制方案(例如：不使用類(lèi)固醇，推遲鈣調神經(jīng)磷酸酶抑制劑的引入)，劑量不同。在設計試驗時(shí)，考慮到這些免疫抑制劑是很重要的，因為同時(shí)免疫抑制可以調節Treg細胞的存活和功能。另一個(gè)未解決的問(wèn)題是，Treg細胞的基因修飾是否可以增強它們對移植排斥反應的體內調節。關(guān)于Treg的異質(zhì)性，盡管新技術(shù)可能有助于加深對Treg細胞及其亞群的理解，但將這些技術(shù)用于常規臨床用途是不切實(shí)際的，在經(jīng)濟上也是不可行的。因此，關(guān)鍵問(wèn)題是，我們需要深入到什么程度？我們可能只利用昂貴的新技術(shù)進(jìn)行臨床前實(shí)驗，以確定和驗證Treg細胞以獲得最佳的體內活性。然后，可以對這些數據進(jìn)行反向工程，使其適用于臨床可用的分析，以便于在更大規模的多中心試驗中使用。

       目前Treg療法盡管試驗數據有限，但在安全性和有效性已經(jīng)初步顯示出了療效。隨著(zhù)基礎科學(xué)研究的發(fā)展和進(jìn)一步的臨床研究，相信Treg細胞在腎移植的應用潛力會(huì )逐步釋放。

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