近年來(lái)，基因毒問(wèn)題是藥物開(kāi)發(fā)、乃至上市后藥品質(zhì)量評價(jià)的重要內容之一，甚至成為了行業(yè)內的“閃點(diǎn)”、“燃點(diǎn)”！然而，大部分同行在聊及基因毒問(wèn)題時(shí)，大都僅停留在警示結構、1.5ug的概念，很少從藥理毒理的角度來(lái)思考基因毒的真正內涵。故，整理此文，望共同進(jìn)步。

       一、什么是遺傳毒？

       遺傳**可分為DNA損傷、基因突變、染色體結構改變和染色體數目改變四類(lèi)。廣義的遺傳**，是指由遺傳毒物引起生物細胞基因組分子結構特異改變而使遺傳信息發(fā)生變化的有害效應；因此，通過(guò)DNA損傷產(chǎn)生突變以及基因組復制過(guò)程誤差率增高皆為遺傳**的表現。而狹義的遺傳**是指遺傳毒物對DNA(或染色體)的損傷作用。

       二、遺傳毒理學(xué)歷史

       1927年，遺傳毒理學(xué)起源于H.J.Muller的開(kāi)創(chuàng )性工作，他的研究發(fā)現放射不僅能夠增高突變的頻率，而且誘發(fā)的突變型或表型與沒(méi)有放射時(shí)所觀(guān)察的完全一致。所以，誘發(fā)的突變反應必須根據基礎突變來(lái)評價(jià)。

        1938年，Sax在Muller研究的基礎上，又研究發(fā)現X射線(xiàn)能夠誘發(fā)紫露草花粉顆粒中染色體結構畸變。在完全缺乏有關(guān)DNA結構和染色體組成的情況下，Sax和他的同事發(fā)現染色體內或染色體間的交換需要在核內至少有兩處大的損傷。另外發(fā)現，接觸X射線(xiàn)總劑量不變，但延長(cháng)接觸時(shí)間，或在幾小時(shí)內分為兩部分接觸，產(chǎn)生染色體畸變的量降低。

       1946年，Auerbach和他的同事們報道了**能誘發(fā)果蠅突變，這些突變與X線(xiàn)誘發(fā)的突變表型是相同的，由此人們開(kāi)始考慮化學(xué)物質(zhì)對遺傳的作用。

       到了20世紀70年代，有兩個(gè)事件使得能用誘變性資料來(lái)評價(jià)危險度。Miller和他的同事們研究發(fā)現化學(xué)致癌物能在體外和體內與DNA、RNA及蛋白質(zhì)作用形成穩定的共價(jià)衍生物。

       同一時(shí)期，第二次發(fā)展改變了遺傳毒理學(xué)領(lǐng)域，那就是Ames（1975）和他的同事們所建立的用傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)的突變試驗；該實(shí)驗可檢測化學(xué)物所致的組氨酸基因座的回復突變，并能結合使用一種外援性S9代謝系統。

       Ames試驗于今天已被廣泛使用，而進(jìn)一步同為20世紀70年代的體內微核試驗，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展和應用，目前已出現使用圖像分析、流式細胞儀和激光掃描細胞儀等多種自動(dòng)化系統檢測微核的方法。

       再之后，1994年Gatehouse等在Mutation Research上發(fā)表了國際遺傳**試驗標準化研討會(huì )上制定的開(kāi)展Ames試驗的一系列建議；且OECD于1997年制定了Ames試驗的指導原則，又進(jìn)一步促進(jìn)了該方法的標準化和應用。

       而今，ICH、OECD等機構已制定并頒布多個(gè)指導原則，用于遺傳毒理學(xué)的研究，并在不斷的持續更新...

       三、我國國內發(fā)布的指導原則

       我國于2007年10月23日發(fā)布了《藥物遺傳**研究技術(shù)指導原則》。在該指導原則起草過(guò)程和審評過(guò)程中一直強調： 指導原則只是原則性指導，且僅能反映當時(shí)的認識！ 研究者不能機械地照搬指導原則，而是應充分發(fā)揮主觀(guān)能動(dòng)性，積極跟蹤學(xué)科進(jìn)展，推動(dòng)研究工作。

       2018年3月，為指導和規范藥物遺傳**研究，國家食品藥品監督管理總局組織修訂了《藥物遺傳**研究技術(shù)指導原則》，且同時(shí)宣布原國家食品藥品監督管理局2007年發(fā)布的《藥物遺傳**研究技術(shù)指導原則》廢止。

        我國最近發(fā)布的指導原則

        標準試驗組合

       指導原則指出：根據試驗檢測的遺傳終點(diǎn)，可將檢測方法分為三大類(lèi)，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據試驗系統，可分為體內試驗和體外試驗。標準試驗組合應反映不同遺傳終點(diǎn)，包括體內和體外試驗，應包含以下內容：1）應包含細菌回復突變試驗（又稱(chēng)Ames試驗），該試驗已證明能檢出相關(guān)的遺傳學(xué)改變和大部分嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)的遺傳**致癌劑；2）應包含哺乳動(dòng)物細胞體外和/或體內試驗。

       表1： 國內指導原則標準試驗組合

       四、ICH頒布的指導原則

       1995年和1997年ICH分別頒布遺傳**指導原則S2A（藥物遺傳**試驗的特殊性指導原則）、S2B（遺傳**：藥物遺傳**試驗標準組合）；ICH遺傳**指導委員會(huì )于2006年6月啟動(dòng)了遺傳**指導原則的修訂工作，并多次在美國、歐盟和日本等地召開(kāi)會(huì )議商討修訂工作，最終于2011年11月正式修訂完成，完成ICH第四進(jìn)程，推薦給ICH管理三方(歐盟、美國、日本)采納使用。

       標準試驗組合

       指導原則指出：選擇一具有更多的歷史應用經(jīng)驗，部分原因是由于該組合被S2A和S2B指導原則推薦。然而，認為選擇一和選擇二同等適合的原因如下：當體外哺乳動(dòng)物細胞試驗結果為陽(yáng)性時(shí)，兩個(gè)實(shí)施良好的體內試驗（采用合適的組織和顯示有充分的暴露）的明確陰性結果，被認為足以證明缺乏體內遺傳**潛在性，因此進(jìn)行兩種體內試驗的試驗策略，與對體外試驗陽(yáng)性結果進(jìn)行追加試驗是相同策略。

       表2：ICH S2（R1）指導原則標準試驗組合

       五、歷史上發(fā)生的藥品基因毒代表性事件

       2007年6月，羅氏制藥在歐洲市場(chǎng)推出的HIV蛋白酶抑制甲磺酸奈非那韋，因為在其產(chǎn)品中發(fā)現一種經(jīng)典的基因**雜質(zhì)~甲基磺酸乙酯超標，EMA暫停了它在歐洲的所有市場(chǎng)銷(xiāo)售。甲磺酸乙酯的引入是由于在生產(chǎn)設備清洗時(shí)，乙醇未被完全烘干而殘留下來(lái)，與甲磺酸奈非那非原料藥中的甲基磺酸反應形成甲基磺酸乙酯。

     羅氏在被要求徹底解決污染問(wèn)題后，還需要補充**研究數據，以更好的評估甲磺酸奈非那非的基因毒雜質(zhì)對患者的風(fēng)險。直到羅氏公司完全解決了這些問(wèn)題后，EMA才恢復了甲磺酸奈非那非在歐洲市場(chǎng)的相關(guān)授權。在這次甲磺酸奈非那非事件發(fā)生之后，世界各國的藥品管理機構均針對基因**雜質(zhì)提出了更加明確的規定和要求，因此，國內外醫藥企業(yè)在新藥的研發(fā)過(guò)程中也越來(lái)越重視基因毒雜質(zhì)的控制和檢測。

       六、小分子藥物中常見(jiàn)的基因毒（雜質(zhì)）問(wèn)題

       那么，如何認識和控制基因毒雜質(zhì)呢？

       基因毒雜質(zhì)的結構多種多樣，對于絕大多數的雜質(zhì)而言，往往沒(méi)有充分的**或致癌研究數據，因而難以對其進(jìn)行歸類(lèi)。在缺乏安全性數據支持的情況下，大多數法規和指導原則采用“警示結構”作為區分普通雜質(zhì)和基因**雜質(zhì)的標志。對于含有警示結構的雜質(zhì)，應當進(jìn)行（Q）SAR預測和體內外遺傳**和致癌性研究，或者將雜質(zhì)水平控制在毒理學(xué)關(guān)注閾（TTC）之下。

       關(guān)于基因雜質(zhì)警示結果的具體詳細信息可參考歐盟發(fā)布的警示結構《Development of structural alerts for the in vivo micro nucleus assay inrodents》，或進(jìn)入The Carcinogenic Potency Database(CPDB)，里面有上千種致癌物質(zhì)的列表、結構式、CAS號，作用部位，TTC值等一系列信息。

       ICH最早給出了的化學(xué)原料藥雜質(zhì)研究指導原則Q3A（R2）、制劑雜質(zhì)研究指導原則Q3B（R2），在這些指導原則中首次提到“對于能夠產(chǎn)生強的藥理活性或**的潛在雜質(zhì)，即使其含量低于0.1%，也必須進(jìn)行進(jìn)一步的結構鑒定”。在之后修訂的版本中，進(jìn)一步明確“要關(guān)注原料藥中的潛在遺傳**雜質(zhì)”，以及“對于**非常強的基因**雜質(zhì)，需要根據實(shí)際情況來(lái)制定更低的檢測限度”，但也并未針對遺傳**雜質(zhì)及其研究和控制問(wèn)題提出明確的闡述，同時(shí)，對其研究原則、限度要求及控制策略均沒(méi)有具體的要求。

       EMEA人用藥品委員會(huì )(CHMP)推出《遺傳**雜質(zhì)限度指導原則》，引入了可接受風(fēng)險的攝入量，即毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）這個(gè)概念。設置了限度值TTC(1.5 μg/day)，即相當于每人每天攝入1.5 μg的基因**雜質(zhì)，被認為對于大多數藥品來(lái)說(shuō)是可以接受的風(fēng)險（一生中致癌的風(fēng)險小于十萬(wàn)分之一）。根據此閾值，按照每日預期的攝入量去計算出該活性藥物中能夠接受的雜質(zhì)水平。值得注意的是，TTC只是一個(gè)概率的方法，具有一定的風(fēng)險。如果存在一個(gè)基因**雜質(zhì)，對其**未知，假設其每日的攝入量在TTC范圍內，那它致癌的概率將會(huì )在10-5以下，因此限度值（TTC）不等于完全沒(méi)有風(fēng)險。PS：針對不同類(lèi)型的藥物，也有不同的閾值及算法。

       表3： 藥品中的基因毒雜質(zhì)分類(lèi)

       七、M7指導原則~非常重要！

       M7于2014年6月由 ICH 指導委員會(huì )在ICH進(jìn)程的第4階段中予以通過(guò)；在ICH 進(jìn)程的第4階段，最后的草案被推薦給歐盟、日本和美國的監管機構采納。

       M7旨在提供一個(gè)可用于致突變雜質(zhì)的鑒別、分類(lèi)、界定和控制的可行性框架，以限制潛在的致癌風(fēng)險。同時(shí)，意在補充 ICH Q3A(R2)、Q3B(R2)和M3(R2)支持藥物進(jìn)行臨床試驗和上市的非臨床安全性研究。PS：M7不適用于ICH S9范圍定義的用于晚期癌癥適應癥的原料藥和制劑。

       M7再次給出了TTC、TD50、1.5μg/天等概念和數據，同時(shí)重點(diǎn)強調了上市后藥品變更后的基因毒雜質(zhì)問(wèn)題；見(jiàn)下表。

       表4： 上市后藥品變更所要面對的基因毒雜質(zhì)問(wèn)題

       八、結語(yǔ)

       基因毒問(wèn)題，最為根本的還是安全性問(wèn)題，而一個(gè)物質(zhì)是否安全、是否存在基因毒，要靠試驗和數據來(lái)證明。至今，我們已經(jīng)知曉了很多基因毒物質(zhì)、也知道了怎么判斷警示結構，但依然出現了NDMA事件！且不論事出原因如何，結果都是藥品的質(zhì)量出問(wèn)題了！不過(guò)，當質(zhì)量出現問(wèn)題之時(shí)，作為一個(gè)藥品從業(yè)人員，反思更多的應該是問(wèn)題出在了哪里？到底我們應該如何做出“安全、有效、質(zhì)量可控”的藥物！