一

       背景概況

       單細胞測序技術(shù)是指能夠在單個(gè)細胞的水平上，對基因組或轉錄組進(jìn)行高通量測序分析的一項新技術(shù)。與傳統高通量測序相比，單細胞測序不僅能夠分析相同表型細胞的異質(zhì)性，還能獲取難以培養微生物的遺傳信息以及珍貴的臨床樣本的信息，具有廣闊的應用前景。

       細胞是生命的單位，目前大部分的基因檢測均是從組織中抽提DNA 來(lái)進(jìn)行測序，得到的實(shí)驗結果往往是細胞群體中信號表達的均值，是對細胞群體進(jìn)行整體表征，或者只代表其中在數量上占優(yōu)勢的細胞信息，單個(gè)細胞獨有的細胞特性往往被忽略。

       而大量研究發(fā)現在同一器官或組織的相同類(lèi)型細胞也表現出顯著(zhù)的異質(zhì)性，每個(gè)細胞都有其獨特的表達模式。例如實(shí)體瘤樣本的總RNA，一半以上來(lái)源于非癌細胞（成纖維細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等），使得癌細胞的信號可能被隱藏。因此，采用均值對單個(gè)細胞進(jìn)行表征是不合適的，可能會(huì )丟失許多關(guān)鍵信息。

       另一方面，傳統高通量測序方法，難以應用在對自然界中難培養的微生物的研究、罕見(jiàn)循環(huán)腫瘤細胞的轉錄組分析、胚胎發(fā)生最早期的分化特征研究、腫瘤的非均質(zhì)性和微進(jìn)化研究等精確程度較高的研究領(lǐng)域[1]。隨著(zhù)細胞分選和測序技術(shù)進(jìn)步，單細胞測序技術(shù)應運而生。

       （一）單細胞測序技術(shù)頗受關(guān)注

       《Nature Methods》雜志將單細胞研究方法列為未來(lái)幾年最值得關(guān)注的技術(shù)領(lǐng)域之一?！禨cience》雜志將單細胞測序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首。

      2008—2018年P(guān)ubmed中單細胞測序技術(shù)文獻數量變化

       數據來(lái)源：Pubmed，火石創(chuàng )造

       （二）單細胞測序技術(shù)流程

       1. 單細胞分離

       針對單個(gè)細胞研究時(shí)，首先將單個(gè)細胞進(jìn)行分離，并確保其生物完整性不被破壞。目前常用的單細胞分離方法有連續稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割術(shù)、拉曼鑷子技術(shù)、熒光激活細胞分選術(shù)和微流控技術(shù)等。

       2. 細胞溶解與基因組獲取

       對細胞進(jìn)行溶解來(lái)獲取基因組（DNA或RNA），這步驟非常關(guān)鍵，應盡量保證基因組的完整性。目前細胞溶解的方法可以分為3大類(lèi): 物理法、化學(xué)法和生物酶降解法。

       3. 全基因組擴增

       由于單個(gè)細胞中的基因含量無(wú)法達到測序儀的檢測線(xiàn)，因此需要對基因組進(jìn)行擴增，目前方法都是利用 DNA 聚合酶和不同形式的引物來(lái)進(jìn)行擴增的，包括特異性的、簡(jiǎn)并的或雜合的引物。

       4.測序與數據分析

       對單個(gè)細胞進(jìn)行測序，并對所得的數據結果進(jìn)行分析。

       二

       單細胞測序技術(shù)應用現狀

       單細胞測序技術(shù)能夠快速確定成千上萬(wàn)個(gè)細胞的精確基因表達模式，分析相同表型細胞的遺傳信息異質(zhì)性。目前已應用于神經(jīng)生物學(xué)、器官生長(cháng)、癌癥生物學(xué)、臨床診斷、免疫學(xué)、微生物學(xué)、胚胎學(xué)、產(chǎn)前基因診斷等多個(gè)領(lǐng)域。

       1. 癌癥研究

       細胞異質(zhì)性是腫瘤的重要特征?；蛐彤愘|(zhì)性是指同一腫瘤內部存在具有不同基因型的腫瘤細胞，而表型異質(zhì)性是指同一腫瘤內部存在具有不同基因表達譜和功能特征的腫瘤細胞。

       眾多科研工作者基于單細胞測序技術(shù)對腫瘤異質(zhì)性進(jìn)行研究，鑒定癌變細胞及癌癥發(fā)展的過(guò)程。XU等[3]對腎腫瘤進(jìn)行單細胞測序，發(fā)現腎腫瘤細胞之間的突變頻率和位置不盡相同，每個(gè)細胞的突變狀態(tài)和轉錄情況也均不相同，表明腎腫瘤更加具有異質(zhì)性，需要開(kāi)發(fā)更加有效的細胞靶向療法。

       2. 發(fā)育研究

       哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育階段的細胞數量極為稀少，其轉錄組分析尤其需要單細胞 RNA-Seq 技術(shù)。

       ZHONG等[4]給予2300個(gè)妊娠胚胎人腦前額葉細胞繪制出人腦前額葉胚胎發(fā)育轉錄組圖譜，發(fā)現在發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)干細胞、興奮性神經(jīng)元細胞、抑制性神經(jīng)元細胞以及星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等六大類(lèi)細胞占主導地位，揭示了神經(jīng)元產(chǎn)生和環(huán)路形成的分子調控機制。

       組織器官發(fā)育是單細胞 RNA-Seq 技術(shù)應用的另一個(gè)重要領(lǐng)域。近年來(lái)陸續報道了多種組織器官(包括肺、腦、腎、血液和內耳)發(fā)育過(guò)程。

       3. 微生物研究

       由于微生物中的基因含量較低以及樣本稀少等原因，傳統的測序方法無(wú)法對難以培養的微生物進(jìn)行測序?；诰_程度較高，單細胞測序技術(shù)能夠對單個(gè)微生物細胞進(jìn)行測序，進(jìn)而發(fā)現新的微生物，加深對微生物生命活動(dòng)過(guò)程的認知。SUZANNE等[5]對某個(gè)稀有海洋微生物進(jìn)行了測序，通過(guò)分析表明該微生物與硫氧化有關(guān)，進(jìn)而發(fā)現了參與有氧代謝有關(guān)的基因。

       三

       國內外政府資金投入情況

       1. 國外政府投入情況

       目前，美國、歐盟等發(fā)達國家和地區政府對單細胞測序領(lǐng)域投入了大量資金，用于促進(jìn)單細胞測序技術(shù)的優(yōu)化與各個(gè)領(lǐng)域的應用[6]。

       自2008年起，美國開(kāi)始資助單細胞測序相關(guān)項目，之后一直呈現平穩增長(cháng)趨勢。自2014年起，關(guān)于單細胞測序的經(jīng)費數及項目數量驟增，呈爆發(fā)性增長(cháng)趨勢，表明美國近幾年對單細胞測序相關(guān)項目的重視。共資助 915 個(gè)項目，累計經(jīng)費 5. 39 億美元。

       另一方面，資助方向主要包括研究領(lǐng)域和應用領(lǐng)域，可細分為分子和細胞基礎研究，感染性疾病、腫瘤、心血管與血液病和神經(jīng)**疾病研究，再生醫學(xué)與干細胞研究，生物多樣性研究，單細胞測序相關(guān)工具、方法的建立，試劑與儀器設備的開(kāi)發(fā)，資源與平臺的建立等。

       2. 我國政府投入情況

       我國單細胞測序技術(shù)起步較晚，2010年，NSFC資助2個(gè)細胞測序相關(guān)研究項目，經(jīng)費77萬(wàn)元。2013 年，隨著(zhù)國際對單細胞測序領(lǐng)域的熱度提升，NSFC 投入1500 萬(wàn)元用于相關(guān)研究，2014—2015 年資助項目數及資助金額雖然稍有回落，但2016 年又迅速增加至23項，超過(guò)2000 萬(wàn)元。

       研究領(lǐng)域主要包括單細胞測序儀器和技術(shù)開(kāi)發(fā)、腫瘤研究與監測、胚胎發(fā)育、微生物基因組研究、醫學(xué)免疫學(xué)、干細胞研究、神經(jīng)科學(xué)、在畜牧學(xué)、獸醫學(xué)中的基礎和應用研究、血液疾病等。

       3. 國內外政府資金投入比較

       目前，我國 NSFC、“863 計劃”和國家重點(diǎn)研發(fā)計劃累計在單細胞測序領(lǐng)域資助經(jīng)費約 1 億元，明顯低于美國不完全統計的 5.4 億美元，甚至英國的4千萬(wàn)英鎊。

      美國和中國對單細胞測序技術(shù)的資金投入情況

       數據來(lái)源：參考文獻[6]

       四

       小結

       單細胞測序以單個(gè)細胞為單位，通過(guò)全基因組或轉錄組擴增，進(jìn)行高通量測序，能夠揭示單個(gè)細胞 的基因結構和基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質(zhì)性，在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)。

       單細胞測序技術(shù)在生物多樣性研究和細胞群體遺傳異質(zhì)性研究方面具有強大優(yōu)勢，將為生命科學(xué)研究人員提供全新的視角研究生命活動(dòng)。我國在單細胞測序相關(guān)項目中的資助力度仍顯不足，隨著(zhù)單細胞測序技術(shù)的深度和廣度逐漸加強，仍需加大對該領(lǐng)域的資金支持，并充分利用現有資源推動(dòng)單細胞測序技術(shù)的進(jìn)步與應用。

       參考文獻

       [1] 朱忠旭,陳新.單細胞測序技術(shù)及應用進(jìn)展[J].基因組學(xué)與應用生物學(xué),2015,34(5):902-908.

       [2] 董燕,宋程程,黃鶴.單細胞測序技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)工業(yè)與工程,2015,32(1):71-78.

       [3] Xu X, Hou Y, Yin X, et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation char-acteristics of a kidney tumor[J]. Cell, 2012, 148(5): 886-895.

       [4] Zhong S, Zhang S, Fan X,et al.A single-cell RNA-seq survey of the developmental landscape of the human prefrontal cortex [J].Nature,2018, 555(7697):524-528.

       [5] Suzanne D L, Bruer S L, Edgmont C A, et al .Ubiquitous dissolved inorganic carbon assimilation by marinebacteria in the Pacific Northwest coastal ocean as determined by stable isotopeprobing[J].PloS One,2012(7): e46695.

       [6]李?lèi)?ài)花,唐小利.美、英及我國政府對單細胞測序研究及應用領(lǐng)域的基金資助[J].中華醫學(xué)圖書(shū)情報雜志,2017,26(9):44-51.

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