在癌癥免疫療法領(lǐng)域，免疫檢查點(diǎn)抑制劑和CAR-T療法無(wú)疑是改變癌癥治療模式的兩大突破。然而，免疫檢查點(diǎn)抑制劑已經(jīng)可以用于治療多種癌癥類(lèi)型，而CAR-T療法的適應癥卻屈指可數。CAR-T療法雖然在治療B細胞血液癌癥方面表現出卓越的療效，然而治療其它類(lèi)型癌癥的CAR-T療法還遲遲未能誕生。

       究其根源，CAR-T療法的設計和開(kāi)發(fā)需要克服三大挑戰：缺少理想的腫瘤抗原作為靶點(diǎn)，腫瘤介導的免疫抑制，和CAR-T療法的嚴重毒副作用。那么，用什么方法可以克服這三大挑戰，提高CAR-T療法的效果并拓寬其應用范圍呢？

       日前，麻省理工學(xué)院（MIT）著(zhù)名跨界學(xué)者盧冠達（Timothy Lu）博士在《Nature Reviews Cancer》上發(fā)表文章，介紹了使用合成生物學(xué)構建新一代“智能”CAR-T療法的最新進(jìn)展。80后的盧冠達博士是MIT電子工程、計算機科學(xué)和生物工程系教授，也是Senti Biosciences、Tango Therapeutics和Synlogic等多家生物技術(shù)公司的創(chuàng )始人。今天，藥明康德微信團隊將和讀者一起分享這篇文章中的精彩內容。

       使用基因回路讓兩種抗原控制CAR-T細胞的激活

       CAR-T細胞療法首先從患者體內收集T細胞，然后通過(guò)基因工程在T細胞表面表達嵌合抗原受體（CAR）。這是一種融合蛋白，它的細胞外蛋白域是一個(gè)識別腫瘤表面抗原的單鏈可變區片段（scFv），而細胞內蛋白域包含了T細胞受體（TCR）和相關(guān)共刺激受體的細胞內蛋白域。這些CAR-T細胞然后被輸回患者體內，它們可以識別和消滅表達指定抗原的腫瘤細胞。

       目前，已有兩種CAR-T療法獲得FDA批準，它們在治療B細胞血癌方面療效突出。然而，目前獲批的CAR-T療法都只能識別一種抗原。發(fā)現一個(gè)能夠特異性標記腫瘤細胞的腫瘤表面抗原是一個(gè)巨大的挑戰，這也是限制CAR-T療法廣泛應用的原因之一。

       例如，靶向CD19的CAR-T細胞能夠有效治療B細胞血癌，然而因為CD19也表達在正常B細胞表面，這類(lèi)療法也會(huì )消滅正常B細胞，從而導致B細胞發(fā)育不全。雖然靶向CD19的CAR-T療法的這一副作用通常不會(huì )致命，而且可以通過(guò)靜脈輸入免疫球蛋白來(lái)進(jìn)行治療，然而，在靶向其它抗原時(shí)，患者可能無(wú)法耐受CAR-T細胞對正常細胞的殺傷。

       合成化學(xué)力圖使用工程學(xué)的理論來(lái)改造活細胞，通過(guò)在細胞中加入基因電路（gene circuits），讓它們能夠感知外來(lái)信號并且作出簡(jiǎn)單的邏輯決策。比如，在設計新一代CAR-T細胞方面，依靠多種抗原來(lái)區分腫瘤細胞和正常細胞，將可以讓CAR-T更為精確靶向腫瘤，并且更具有適應性。

       例如，合成生物學(xué)可以設計出一種T細胞，它必須識別腫瘤表面表達的兩種抗原才會(huì )被激活。這一設計可以通過(guò)人工合成的Notch受體（synNotch）來(lái)實(shí)現。synNotch受體在與腫瘤表面的特定抗原A結合后，通過(guò)釋放轉錄因子，能夠激發(fā)CAR-T細胞表達靶向第二個(gè)抗原B的CAR。在這種情況下，CAR-T細胞只有在接觸到抗原A，再接觸到抗原B的時(shí)候才會(huì )被激活。

       這一synNotch技術(shù)最初由加州大學(xué)舊金山分校的Wendell Lim博士率領(lǐng)的團隊開(kāi)發(fā)，并且在動(dòng)物實(shí)驗中得到驗證。Lim博士共同創(chuàng )建了名為Cell Design Labs的公司來(lái)轉化這一技術(shù)。在2017年12月，吉利德科學(xué)旗下的Kite Pharmaceuticals公司以可高達5.67億美元的數額收購了Cell Design Labs，將這一技術(shù)納入該公司的CAR-T開(kāi)發(fā)平臺。

       而在位于紐約的紀念斯隆-凱特琳癌癥中心（MSKCC），Michel Sadelain博士領(lǐng)導的團隊設計出了同樣依靠?jì)煞N不同抗原的另一類(lèi)CAR-T療法。這一設計利用在正常細胞表面表達的抗原，抑制CAR-T細胞的功能。在這種設計中，CAR-T細胞表面表達著(zhù)兩種不同的CAR，一種是激活性CAR，它與腫瘤表面表達的特定抗原A的結合能夠激活T細胞。而另一種是抑制性CAR（iCAR），它將靶向正常細胞表面表達的抗原B的抗體與免疫檢查點(diǎn)蛋白CTLA-4或PD-1受體的細胞內域融合在一起。這種iCAR在與抗原結合后能夠抑制T細胞的激活。當表達兩種CAR的T細胞同時(shí)接觸到兩種抗原時(shí)，抑制性CAR會(huì )抑制激活性CAR的作用。所以，這種CAR-T細胞只有在接觸到腫瘤特異性抗原A，但是不接觸到正常細胞中表達的自體抗原B時(shí)才會(huì )被激活。

       接受CAR-T療法治療的腫瘤會(huì )通過(guò)降低靶向抗原的表達來(lái)逃避CAR-T細胞的攻擊。例如，很大一部分接受抗CD19 CAR-T細胞療法的患者出現癌癥復發(fā)的原因是腫瘤細胞丟失了CD19抗原的表達。因此，設計能夠識別在腫瘤細胞上表達的多種抗原的CAR-T系統可能讓CAR-T細胞的功能更為全面，防止因為抗原丟失導致的癌癥復發(fā)。

       通過(guò)注入兩種靶向不同腫瘤抗原的CAR-T療法，或者在同一T細胞上表達兩種不同CAR，可以實(shí)現同時(shí)識別腫瘤上的兩種抗原。而最新的研究方向是在一個(gè)CAR的細胞外蛋白域中納入兩個(gè)靶向不同抗原的scFvs，生成一個(gè)雙特異性CAR。例如，靶向CD19和CD20的雙特異性CAR已經(jīng)在動(dòng)物試驗中防止CD19陰性的腫瘤復發(fā)。而靶向CD19和CD22的雙特異性CAR-T療法也表現出良好的臨床前活性。

       使用藥物精確調控CAR-T細胞的活性

       目前，在將CAR-T細胞輸回患者體內后，如何調控免疫反應的強度是一個(gè)難題。例如，與CAR-T療法相關(guān)的嚴重副作用包括細胞因子釋放綜合征和神經(jīng)**。這些毒副作用產(chǎn)生的原因是，將CAR-T細胞輸回患者體內后，我們缺乏有效的手段來(lái)控制CAR-T細胞的增殖、活性和在體內的分布。

       為了更精準地控制CAR-T細胞的數量和活性，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出能夠促發(fā)CAR-T細胞“自殺”的安全開(kāi)關(guān)。以Bellicum Pharmaceuticals公司開(kāi)發(fā)的CaspaCIDe技術(shù)為例，研究人員在CAR-T細胞中加入了一個(gè)能夠被名為rimiducid的小分子藥物激活的胱天蛋白酶9（Caspase 9）融合蛋白。激活胱天蛋白酶9能夠導致CAR-T細胞發(fā)生細胞凋亡，從而終止過(guò)度的CAR-T細胞活性。這一安全系統已經(jīng)被納入該公司的主打通用型T細胞產(chǎn)品rivogenlecleucel中。在人體試驗中，它能夠在注入藥物30分鐘之內就啟動(dòng)細胞凋亡。

       而另一種通過(guò)藥物來(lái)對CAR-T細胞活性進(jìn)行微調的設計方式是，讓CAR的最初狀態(tài)處于未激活狀態(tài)，只有在抗原和其它調控藥物存在的情況下才能夠被激活。Bellicum公司的GoCAR-T技術(shù)讓CAR的共刺激受體部分受到rimiducid的調控，只有在CAR-T細胞與腫瘤抗原蛋白接觸，并且接受rimiducid治療時(shí)，CAR-T細胞才能夠被激活。該公司目前將這一技術(shù)用于治療實(shí)體瘤的CAR-T產(chǎn)品BPX-601中，目前它已經(jīng)進(jìn)入臨床期開(kāi)發(fā)，在1/2期臨床試驗中接受檢驗。

       而上面提到過(guò)的UCSF的Wendell Lim博士的研究團隊采用另外一種設計用藥物激活CAR-T細胞活性。他們將傳統的嵌合抗原受體分為兩個(gè)部分，只有在這兩個(gè)部分被藥物連接起來(lái)后，CAR才能夠激活下游信號通路，引起免疫反應。

       克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的障礙

       CAR-T療法治療實(shí)體瘤需要克服的一個(gè)重要挑戰是腫瘤微環(huán)境介導的免疫抑制。它可能抑制T細胞的運輸和激活，導致雖然CAR-T細胞能夠識別腫瘤抗原，但是仍然不能夠有效行使它的免疫功能。解決這一挑戰的策略之一是為CAR-T細胞武裝上新的“武器”，例如讓它們表達免疫刺激因子IL-12，IL-15或者CD40L。

       例如，MSKCC的Renier J. Brentjens博士率領(lǐng)的研究團隊通過(guò)讓CAR-T細胞持續表達IL-12，在動(dòng)物試驗中讓這些“武裝”起來(lái)的CAR-T細胞能夠克服腫瘤微環(huán)境的抑制作用。這一團隊還設計出表達抗PD-1抗體的CAR-T細胞，消除免疫檢查點(diǎn)蛋白對CAR-T細胞的抑制。

       然而，讓CAR-T細胞持續表達IL-12等促炎癥細胞因子可能帶來(lái)全身性的毒副作用，因為在全身血循環(huán)中流動(dòng)的CAR-T細胞可以不斷釋放IL-12。為了對IL-12的釋放進(jìn)行調控，UCSF的Wendell Lim博士設計出了使用synNotch控制的治療系統，通過(guò)synNotch來(lái)在腫瘤微環(huán)境中特異性釋放IL-12等細胞因子，或者其它治療性蛋白。這些手段都可以納入CAR-T細胞的設計中，進(jìn)一步增強CAR-T細胞克服腫瘤微環(huán)境的能力。

       結語(yǔ)

       合成生物學(xué)已經(jīng)可以通過(guò)為CAR-T療法增添基因回路，擴展療法的可控性和適應能力。我們仍然需要更多的試驗來(lái)證明這些新設計在臨床情況下的效果和安全性。盧冠達博士在綜述中同時(shí)指出，這些基因回路的復雜性意味著(zhù)，將它們導入細胞并且整合入基因組將成為研發(fā)過(guò)程的瓶頸。我們需要更精簡(jiǎn)的基因回路設計和更有效的遞送載體。

       合成生物學(xué)在癌癥治療方面的應用仍然處于初級階段，我們期待更多的基礎科學(xué)、轉化科學(xué)和臨床研究讓基于基因回路的細胞療法在臨床醫藥開(kāi)發(fā)方面展現它的威力。

       參考資料：

       [1] Wu et al., (2019). Engineering advanced cancer therapies with synthetic biology. Nature Reviews Cancer, https://doi.org/10.1038/s41568-019-0121-0

       [2] A suicide switch for CAR-T? Retrieved April 15, 2019, from https://www.iqvia.com/blogs/2019/01/a-suicide-switch-for-car-t

       [3] Bellicum Pharmaceuticals. Retrieved April 15, 2019, from http://www.bellicum.com/

       [4] Cellectis. Retrieved April 15, 2019, from https://www.cellectis.com

       [5] Controlling CAR-T: How scientists plan to make the engineered T cell therapy safer, and work for more cancers. Retrieved April 15, 2019, from https://cen.acs.org/pharmaceuticals/oncology/Controlling-CAR-T-scientists-plan/96/i19

       [6] Wu et al., (2015). Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science, doi: 10.1126/science.aab4077

       [7] Roybal et al., (2016). Engineering T Cells with Customized Therapeutic Response Programs Using Synthetic Notch Receptors. Cell, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.011

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