CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的有效運行依賴(lài)于Cas9酶在特定目標位點(diǎn)切割DNA。但是，這一技術(shù)卻面臨著(zhù)“脫靶”的風(fēng)險，即Cas9酶可能會(huì )在錯誤的位置剪切。我們都知道，編輯了“預想之外”的基因，很有可能會(huì )帶來(lái)不可預控的嚴重后果。
通常，我們檢測非靶標突變（off-target mutations）的方法是：先利用計算機算法預測出最可能被“錯誤擊中”的區域，然后再檢查這些“危險區域”的缺失和插入情況。
9月12日，《Nature》期刊最新發(fā)表一篇題為“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”的研究，揭示了一種預測基因組編輯中“錯誤突變”的新策略，并在小鼠試驗中證實(shí)精心設計的引導RNA鏈不會(huì )產(chǎn)生任何可檢測到的錯誤突變。
“脫靶效應”有多嚴重
非靶向剪切可能發(fā)生在對生物功能沒(méi)有影響的基因組位置，也可能會(huì )破壞細胞的基本功能。通常，研究人員會(huì )利用計算機程序進(jìn)行預測，但是這些預測依賴(lài)于引導RNA如何與DNA結合以及Cas9如何切割的假設。
2017年5月，《Nature Methods》期刊曾發(fā)表一篇文章，揭示CRISPR能夠引入數百種意想不到的突變。他們發(fā)現，CRISPR確實(shí)能夠成功糾正引發(fā)失明的基因，但兩只接受了基因治療的小鼠的基因組中存在超過(guò)1500個(gè)單核苷酸突變以及超過(guò)100處更大片段的缺失和插入。需要強調的是，這些DNA突變都沒(méi)有被計算機算法預測出來(lái)。
雖然錯誤概率遠超我們的認知，但是我們依然缺乏一種能夠準確預測CRISPR非靶標編輯的方法，這意味著(zhù)，目前我們還不清楚這些預測突變是否會(huì )發(fā)生以及發(fā)生的頻率如何。
最新研究：引導RNA 是關(guān)鍵
文章作者、瑞典阿斯利康公司的生物學(xué)家Marcello Maresca表示，公司的一個(gè)長(cháng)期目標是能夠使用基因編輯技術(shù)治療一些人類(lèi)疾病。“然而，要想實(shí)現CRISPR藥物的潛力，就需要開(kāi)發(fā)出一種方法，能夠讓目標基因得到有效修飾，且基因組其他位置不受影響。”
在這項新研究中，Maresca團隊與哈佛大學(xué)和麻省總醫院的生物學(xué)家、病理學(xué)家J. Keith Joung課題組合作，開(kāi)發(fā)了一種“體內非靶點(diǎn)驗證”的方法（verification of in vivo off-targets，VIVO），可以穩定地鑒定出CRISPR在體內全基因組中的脫靶效應。
首先，他們以小鼠基因組為研究對象，在體外將其DNA剪切成片段，每個(gè)片段約包含300個(gè)堿基對，然后連接一系列使DNA形成閉環(huán)的“接口”（adapters）。隨后，他們引入一個(gè)Cas9核酸酶和引導RNA復合體，它們會(huì )在環(huán)狀DNA的一些位點(diǎn)上進(jìn)行切割，使其線(xiàn)性化。最后，研究人員會(huì )添加另一批核酸酶，負責降解剩余未被剪切的閉環(huán)DNA。
通過(guò)這一系列步驟，研究人員可以對線(xiàn)性化的DNA進(jìn)行測序，以檢測Cas9在哪些位置進(jìn)行了切割（無(wú)論是有意的還是無(wú)意的），同時(shí)預測引導RNA是否會(huì )在體內引發(fā)脫靶效應。
以上體外驗證工作是J. Keith Joung團隊于2017年完成的工作（發(fā)表在《Nature Methods》期刊）?，F在，他們將成果轉移至體內：利用一引導RNA（在體外預測中，發(fā)現其會(huì )在基因組中造成數千個(gè)錯誤剪切位點(diǎn)）進(jìn)行小鼠體內試驗。結果顯示，超40%的預測位點(diǎn)在小鼠肝 臟中確實(shí)發(fā)生了突變。
而且，在體外預測中，一個(gè)位點(diǎn)出現的頻率越高，它在體內發(fā)生突變的可能性就越大。換句話(huà)說(shuō)，引導RNA在體外是“粗心”的，在體內肯定也是粗心的。
研究團隊還檢測了小鼠體內試驗中基因組上的特殊位點(diǎn)——這些點(diǎn)在計算機預測中都屬于可能的脫靶位點(diǎn)，但是在體外試驗中并沒(méi)有出現——結果發(fā)現，在體內試驗中這些位點(diǎn)并沒(méi)有出現突變。這意味著(zhù)，體外試驗并沒(méi)有錯過(guò)真正的非目標剪切。
更重要的是，他們證實(shí)，設計對靶點(diǎn)高度特異性的引導RNA，可以有效指導小鼠肝 臟細胞的基因編輯，且不會(huì )出現可檢測到的非靶向突變。
這項研究證實(shí)“你確保有一個(gè)真正準確的引導RNA”，多倫多大學(xué)的發(fā)育生物學(xué)家Janet Rossant表示，“這項研究的突破性在于，VIVO能夠檢測出細胞特定的非靶標突變，而不是依賴(lài)于參考基因組序列（不一定能夠反映你所研究的有機體的遺傳背景，或者在臨床應用中患者的遺傳背景）。由于可以針對來(lái)自于患者或者特定有機體的基因組DNA在體外進(jìn)行篩選，因此測序步驟的讀取結果反映了受試者基因組中可能的Cas9目標。”
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