傳統的CRISPR組件包括基礎版釀膿鏈球菌Cas9酶（SpCas9）、引導RNA（gRNA）。其中，SpCas9 會(huì )在gRNA的指引下與特定DNA結合，并對其剪切。在臨床應用中，許多研究團隊會(huì )構建“醫療包”——將Cas9基因和其他關(guān)鍵組件包裹進(jìn)一個(gè)無(wú)害的病毒中，從而進(jìn)入體內細胞實(shí)現遺傳缺陷的精準修復。
然而，考慮到SpCas9蛋白由1,368個(gè)氨基酸組成，體積太大不能通過(guò)病毒包裝和遞送。對此，科學(xué)家們希望設計出更精簡(jiǎn)版的Cas9。
來(lái)自伯克利加州大學(xué)的結構生物學(xué)家David Savage帶領(lǐng)的研究團隊利用了一個(gè)“定向進(jìn)化”的計劃設計了一個(gè)更“苗條”版的Cas9s，并于上周在冷泉港CRISPR年會(huì )上分享了最新的研究成果。
改造細則
他們將改造這一蛋白的方法稱(chēng)為：通過(guò)迭代凝膠排阻方法最小化（Minimization by Iterative Size-Exclusion Recombination，MISER）。首先，這項技術(shù)使用兩種酶系統化剪切SpCas9的基因序列，提取出其中編碼不同蛋白結構域的部分序列。
隨后，David Savage和團隊檢測這些分割開(kāi)的基因序列，以驗證它們是否仍然保留著(zhù)Cas9結合DNA的能力。他們將有能力的片段組合起來(lái)，并添加了特異的truncated options。迄今為止，他們已經(jīng)獲得了50萬(wàn)種變體。“讓我們意外的是，‘縮減’后的Cas9可以忍受巨大的基因缺失，工作良好且靈活。” David Savage解釋道。
早前韓國科學(xué)家曾在空腸彎曲桿菌中發(fā)現了小型的Cas9酶CjCas9，由984個(gè)氨基酸組成?，F在，這一最新改造再次“升級”，獲得的最小化的MISER Cas9突變體僅僅只包含880個(gè)氨基酸，約為原始SpCas9大小的三分之二。
突破和挑戰
MISER突變不一定可以實(shí)現傳統CRISPR-Cas9系統所能完成的一切潛能。其中一個(gè)障礙是：一些突變的Cas9s可以鎖定基因組中的特定靶點(diǎn)，但是并不能切斷DNA。
但是，這個(gè)功能缺陷的Cas9s同樣也是一個(gè)方便的工具，可以運送其他分子到達特定的目的地。一個(gè)特別強大的CRISPR技術(shù)——“堿基編輯”（base editing）則是利用該工具將一種關(guān)鍵酶運送至特定堿基，隨后實(shí)現單堿基的置換。
哈佛大學(xué)的化學(xué)家David Liu是全球率先研發(fā)出單堿基編輯技術(shù)的科學(xué)家，他認為此次David Savage團隊的研究是“新方法的一個(gè)早期應用，能夠促進(jìn)基因編輯領(lǐng)域更接近于一個(gè)長(cháng)期目標”。
其他“升級”版Cas9
CRISPR的“光環(huán)”很強大，從基因工具到臨床治療，這一技術(shù)有著(zhù)巨大的潛能。然而，脫靶效應一直是該技術(shù)應用的瓶頸之一。如何降低脫靶效應？科學(xué)家們想出很多妙招。
2015年末，張鋒團隊通過(guò)改變構成化膿性鏈球菌Cas9酶的約1，400個(gè)氨基酸中的3個(gè)氨基酸，研發(fā)出“增強型”釀膿鏈球菌Cas9（eSpCas9），將“脫靶編輯”顯著(zhù)減少至無(wú)法檢測到的水平。2016年初，麻省總醫院的研究團隊猜測，降低Cas9酶與靶DNA之間的互相作用或許可以更加完全地消除脫靶效應。為了驗證推測，他們通過(guò)替換DNA鏈重組Cas9酶變體，最終獲得SpCas9-HF1，證實(shí)其可以顯著(zhù)降低脫靶效應。（詳細）
2017年，CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna團隊利用單分子FRET（(Förster resonance energy transfer）技術(shù)發(fā)現，Cas9與sgRNA形成的復合物中的REC3結構域負責感知靶向結合（target binding）的準確性，然后向REC2結構域發(fā)出信號，讓其為HNH核酸酶域打開(kāi)一條通路，最終激活Cas9的“剪刀作用”。通過(guò)改變REC3部分，研究團隊設計出了一種改良版的、超精確的（hyper-accurate）Cas9——HypaCas9，有望克服脫靶效應。（詳細）
2018年，David R. Liu團隊帶來(lái)了“升級版”的Cas9 變體——xCas9， 證實(shí)其在基因編輯時(shí)更靈活、更精確，可以靶向更多的基因位點(diǎn)，并減少“錯誤編輯”的風(fēng)險。他們發(fā)現，相比于Cas9，xCas9錯誤編輯的概率降低了。
此外，科學(xué)家們還找到了靶向RNA的基因編輯酶C2c2（Cas13a）、CasRx（Cas13d）以及有任意切割單鏈DNA潛能的Cas12a（Cpf1）……未來(lái)，我們期待更多的基因編輯酶，給予更多的用途和潛能。
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