這兩項研究表明，長(cháng)久以來(lái)流行的抗CTLA-4抗體Ipilimumab在癌癥免疫治療中的免疫檢查點(diǎn)假說(shuō)并不成立，即Ipilimumab并沒(méi)有通過(guò)阻斷CTLA-4/B7相互作用而發(fā)揮抗腫瘤效果，而清除Fc受體介導的高表達CTLA-4的腫瘤局部調節性T細胞（Treg）則在有效的免疫治療中至關(guān)重要。作者利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型，模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯(lián)用造成的各個(gè)臟器的免疫副作用，并評估了其它抗CTLA-4抗體的安全性，闡明了失調的自身反應性Treg及全身T細胞的活化是造成免疫副作用的根本原因。這些研究成果對今后研發(fā)新一代高效并且安全的抗CTLA-4抗體以及其它以CTLA-4為靶點(diǎn)的藥物有著(zhù)深遠的指導意義。

       近年來(lái)，隨著(zhù)腫瘤免疫調控機制的逐漸清晰和基因改造技術(shù)的不斷提高，腫瘤免疫治療領(lǐng)域得到了空前發(fā)展。尤其是近幾年來(lái)，免疫檢查點(diǎn) （Immune Checkpoint）單抗藥物與嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞免疫治療的效果逐漸獲得認可，癌癥免疫治療的概念也越來(lái)越深入人心。目前腫瘤免疫藥物治療的最主要方面是腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑，即通過(guò)抑制腫瘤細胞的免疫逃逸，調動(dòng)自身免疫系統功能來(lái)消除腫瘤，當前的研究主要集中在CTLA-4、PD-1和PD-L1三個(gè)分子上。

       CTLA-4分子高表達于調節性T淋巴細胞（Treg）和激活的T淋巴細胞上。正常情況下，T淋巴細胞的活化需要兩條信號通路共同激活，其一是T細胞受體（TCR）與抗原呈遞細胞（APC）呈遞的MHC-抗原肽復合物相結合（信號1），其二是B7分子（B7-1或B7-2）與T細胞表面的共刺激分子CD28相結合（信號2）。T細胞活化后高表達的CTLA-4分子雖然與CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA-4分子與B7分子結合后抑制T細胞的活化。

       2011年，美國FDA批準首款抗CTLA-4抗體抑制劑Ipilimumab（商品名YERVOY?）用于黑色素瘤的治療，療效顯著(zhù)。根據免疫檢查點(diǎn)阻斷的假說(shuō)（Checkpoint Blockade Hypothesis），在外周淋巴器官，抗CTLA-4抗體如Ipilimumab是主要通過(guò)阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路【圖1】，從而促進(jìn)T細胞的激活而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而這一流行的關(guān)于Ipilimumab在癌癥免疫治療中發(fā)揮作用的主要假說(shuō)并沒(méi)有得到嚴格的實(shí)驗驗證。

       圖1. T細胞的活化需要通過(guò)TCR/MHC（信號1）和CD28/B7（信號2）進(jìn)行共刺激。 抗原呈遞細胞（APC）上的B7分子（包括B7-1和B7-2）與T細胞上的CTLA-4的結合抑制T細胞功能。 抗CTLA-4抗體阻斷CTLA-4結合B7并阻止其對T細胞功能的抑制。

       雖然Ipilimumab可以阻斷錨定狀態(tài)的（Immobilized ）CTLA-4分子和游離的（Soluble ）B7分子的相互作用【圖2A】（J Immunol. 2003 Dec 1;171(11):6251-9.），但B7分子是膜表面表達的共刺激分子，因此以前的研究并不能證實(shí)Ipilimumab能夠有效阻斷在生理狀態(tài)下的CTLA-4和B7的相互作用。劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的研究表明，當B7分子被固定后（比如B7包被在ELISA板上時(shí)【圖2B】或者表達在細胞表面【圖2C】），Ipilimumab（包括臨床上使用的Ipilimumab以及按照已公布的抗體序列由不同公司合成的Ipilimumab）在體外并不能很好地阻斷細胞表面的CTLA-4/B7的相互作用【圖2D】，也不能有效地阻斷CTLA-4介導的B7分子的轉胞吞（Transendocytosis）作用【圖2E】。與此不同的是，劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室篩選出的另外一種抗CTLA-4的半人源化的抗體L3D10 （Blood. 2005 Feb 1;105(3):1114-20.和Blood. 2005 Nov 1;106(9):3127-33.），卻能非常顯著(zhù)地阻斷各種形式的CTLA-4/B7的體外相互作用【圖2】。 此外，在human CTLA-4 knock-in的人源化小鼠和human CD34+ stem cells重組的NSG小鼠中，L3D10——而不是Ipilimumab——能夠顯著(zhù)抑制human CTLA-4對脾 臟樹(shù)突狀細胞表面B7分子的轉胞吞下調【圖2F】，從而提供了在體內實(shí)驗中的生理狀態(tài)下Ipilimumab不能有效阻斷CTLA-4/B7相互作用的證據。

       圖2. 當B7分子被固定時(shí)，L3D10——而不是Ipilimumab——能夠在體外和體內顯著(zhù)阻斷CTLA-4/B7的相互作用。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）

       更重要的是，劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的研究指出，阻斷CTLA-4/B7的相互作用，并沒(méi)有貢獻于抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果。這一論斷來(lái)自多個(gè)方面的實(shí)驗證據：

       1）在human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h，即CTLA4的兩個(gè)等位基因均來(lái)自human）的小鼠模型中，抗human CTLA-4的抗體L3D10能夠有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用；而在human CTLA-4半人源化（CTLA4h/m，即CTLA4的兩個(gè)等位基因一個(gè)來(lái)自human，一個(gè)來(lái)自mouse）的小鼠模型中，只能識別human CTLA-4的L3D10不能有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用。盡管如此，在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中，L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38腫瘤【圖3A、圖3B】和減緩B16腫瘤的生長(cháng)。

       2）將半人源化的L3D10進(jìn)行完全人源化后篩選得到的兩株失去阻斷CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗體【圖3C】，并沒(méi)有影響其抗腫瘤的作用，因為HL12和HL32展現出與Ipilimumab一樣的抗腫瘤效果【圖3D】。

       3）用B7分子的阻斷性抗體1G10/GL1處理實(shí)驗小鼠，在事先阻斷B7功能的情況下，Ipilimumab仍能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，進(jìn)一步說(shuō)明其并不依賴(lài)于阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路【圖3E】。

       4）三種常見(jiàn)的抗mouse CTLA-4抗體（4F10/9D9/9H10），它們阻斷CTLA-4/B7相互作用的能力差別很大（如9D9和L3D10一樣具強阻斷能力，而9H10則不顯示或者具備非常弱的阻斷能力）。然而，文獻報道它們都具備非常好的抗腫瘤作用。

       圖3. 抗CTLA-4抗體治療腫瘤的主要分子機制是通過(guò)清除腫瘤局部的Treg，而不是通過(guò)阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號通路。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）

       深入研究表明，所有能有效抗腫瘤的抗CTLA-4抗體，包括強阻斷能力的L3D10和非常弱阻斷能力的Ipilimumab/HL12/HL32，都能夠有效的清除腫瘤局部的Treg【圖3F，圖3G】。而用Fc受體的阻斷抗體2.4G2同時(shí)處理小鼠來(lái)消除抗體介導的細胞殺傷作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）和抗體介導的細胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP），則能顯著(zhù)逆轉Ipilimumab的抗腫瘤效果【圖3H】。因此，劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的研究表明，抗CTLA-4抗體發(fā)揮治療腫瘤功效的主要分子機制是通過(guò)清除腫瘤局部的Treg，而不是通過(guò)阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號通路。這項研究有力地駁斥了當前流行的在癌癥免疫治療中針對CTLA-4分子的免疫檢查點(diǎn)的理論假說(shuō)。

       劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室在CTLA-4領(lǐng)域的另一個(gè)方面的研究，集中在建立和評估抗CTLA-4抗體在免疫治療誘導的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events）的小鼠模型。Ipilimumab作為腫瘤免疫治療的杰出代表，具有非常好的抗黑色素瘤的作用，同時(shí)也有非常強的免疫治療誘導的副作用（N Engl J Med. 2015 Jul 2;373(1):23-34.）。臨床研究表明，針對多靶點(diǎn)的更有效的聯(lián)合用藥是免疫治療的臨床推進(jìn)方向，例如Ipilimumab和Nivolumab （抗PD-1的抗體）強強聯(lián)合后抗腫瘤效果大增。然而，一半以上的患者產(chǎn)生了3-4級嚴重的副作用，因此限制了抗CTLA-4抗體的研發(fā)與應用（Lancet Oncol. 2017 Jan;18(1):31-41.和N Engl J Med. 2017 Nov 9;377(19):1824-1835.）。 目前，并沒(méi)有一個(gè)非常好的臨床前模型來(lái)評估抗CTLA-4抗體的免疫治療誘導的副作用。

       圖4. 利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型來(lái)模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯(lián)用造成的免疫副作用，并評估Ipilimumab和其它抗CTLA-4抗體的安全性。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）

       研究發(fā)現， CTLA-4人源化的新生小鼠模型【圖4A】，可以用來(lái)有效地模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯(lián)用造成的各個(gè)臟器的免疫副作用。這些副作用的表型和臨床發(fā)現的Ipilimumab單獨治療或聯(lián)合抗PD-1抗體治療后產(chǎn)生的副作用表型非常相似【圖4B】。比如，貧血，心肌炎，肺炎，肝炎，腎 臟等多器官炎癥。值得注意的是，半人源化抗體L3D10以及其完全人源化后的突變體抗體HL12和HL32在取得與Ipilimumab一樣的甚至強于Ipilimumab的抗腫瘤效果的情況下，并沒(méi)有產(chǎn)生嚴重的副作用【圖4C】。同樣，利用human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h ）和半人源化（CTLA4h/m）的新生小鼠模型，研究者發(fā)現，再現Ipilimumab的免疫副作用需要CTLA4雙等位基因的參與，因為在半人源化新生小鼠模型中， Ipilimumab并沒(méi)有顯示出強烈的副作用【圖4D】。

       此外，研究者還發(fā)現這種免疫治療誘導的副作用，和全身的T細胞激活相關(guān)，特別是自我反應性T細胞中調節性T細胞（Treg）和效應T細胞（Teff）的比例起決定性的作用。這項研究表明，抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果和免疫治療副作用的產(chǎn)生并不一定是相伴相隨的，因為它們的分子機制是不一樣的（一個(gè)依賴(lài)于腫瘤局部Treg的刪除，一個(gè)依賴(lài)于自體反應性T細胞的擴增和全身T細胞的激活， 【圖5】）。

       圖5. 抗CTLA-4抗體在免疫治療誘導的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events ）和 癌癥免疫治療效果（CITE，cancer immunotherapeutic effect）中有著(zhù)截然不同的分子機制。 irAE是外周淋巴器官中自體反應性T細胞的多克隆擴增造成的，主要是通過(guò)抑制自身反應性T細胞轉化成自身反應性Treg細胞。 CITE引起的腫瘤排斥是通過(guò)FcR介導的特異性清除腫瘤微環(huán)境中的Treg細胞來(lái)實(shí)現的，并且此過(guò)程獨立于外周淋巴器官中天然T細胞的活化。此外，irAE和CITE都不依賴(lài)于對CTLA-4/B7相互作用的阻斷。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）

       劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的一系列突破性研究成果，進(jìn)一步闡明了抗CTLA-4抗體的抗腫瘤分子機制，提供了有效的評價(jià)抗CTLA-4抗體藥物安全性的小鼠模型，并初步篩選到相對于Ipilimumab更加安全的抗CTLA-4抗體克隆株HL12和HL32，這些研究對今后第3代抗CTLA-4抗體以及以CTLA-4為靶點(diǎn)的其它類(lèi)型藥物的研發(fā)有著(zhù)重要的指導意義。

       據悉，本研究完成于美國國立兒童醫學(xué)中心的癌癥與免疫學(xué)研究中心。杜雪相博士、唐飛博士和劉明月博士為兩篇論文的共同第一作者，劉陽(yáng)教授和鄭盼教授為共同通訊作者。

       參考文獻：

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       May, K. F., et al. Anti-human CTLA-4 monoclonal antibody promotes T cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies. Blood 105, 1114–1120 (2005).

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       Weber, J., et al. Adjuvant Nivolumab versus Ipilimumab in resected stage III or IV melanoma. N. Engl. J. Med. 377, 1824–1835(2017).

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