David Liu（Credit: Martin Adolfsson）
自2012年被證實(shí)具有基因組編輯功能以來(lái)，CRISPR/Cas9已經(jīng)成為深受實(shí)驗室喜歡的工具，并在糾正致病突變、尋找癌癥免疫療法的必需基因、解決器官異種移植關(guān)鍵難題等領(lǐng)域創(chuàng )造了多個(gè)突破和成果。但是該技術(shù)仍然存在一些局限性，例如“編輯范圍有限”、“脫靶效應”等。
很多研究團隊一直試圖優(yōu)化這一工具。哈佛大學(xué)/Broad研究所的化學(xué)生物學(xué)家David R. Liu就是其中一員。2月28日，其團隊在《Nature》期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為“Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity”的文章。他們研發(fā)出一種Cas9酶的變體，是基礎版釀膿鏈球菌Cas9酶（SpCas9）的“升級版”。
doi:10.1038/nature26155
David R. Liu將其命名為“xCas9”，并證實(shí)其在基因編輯時(shí)更靈活、更精確——可以靶向更多的基因位點(diǎn)，并減少“錯誤編輯”的風(fēng)險。
CRISPR系統的關(guān)鍵在于Cas9酶在引導RNA（gRNA）的指引下負責切割特定的DNA序列。其中，spCas9的識別依賴(lài)于特定的PAM序列（位于編輯位點(diǎn)附近），該序列的一個(gè)末端是由特定的三堿基排列組成的。這種排列簡(jiǎn)稱(chēng)為N，由組成DNA的任一種堿基（A、G、C、T）再加上2個(gè)鳥(niǎo)嘌呤（G）組成。反觀(guān)人類(lèi)基因組，只有1/16的區域含有此類(lèi)PAM序列（NGG）。這無(wú)疑限制了基因編輯的范圍。
The genome editor CRISPR cuts DNA with help from a guide RNA (green and red) and a Cas9 enzyme (outline) that latches onto a three-base sequence (yellow). KC ROEYER/UNIVERSITY OF CALIFORNIA, BERKELEY
為了打破這一局限，David R. Liu實(shí)驗室嘗試改造，使其能夠在多種PAM序列旁進(jìn)行切割。通過(guò)phage-assisted continuous evolution（PACE）方法，最終他們獲得了xCas9——其可以廣泛識別多種PAM序列，包括NG、GAA和GAT，編輯范圍至少增加了4倍，可以靶向編輯基因組的1/4區域。
研究團隊對xCas9進(jìn)行多種測試，驗證其與“base editors”工具結合時(shí)置換單個(gè)剪輯的能力。讓他們驚喜的是，相比于Cas9，xCas9錯誤編輯的概率降低了。
David R. Liu強調，對于xCas9酶的潛能，依然需要時(shí)間驗證。他和團隊目前只測試了幾十個(gè)位點(diǎn)，相比于xCas9成千上萬(wàn)的目標只是“冰山一角”。“我并不能確定，xCas9一定優(yōu)于spCas9。所以我希望更多的人來(lái)檢測它，因為我想知道答案。” David R. Liu表示道。
參考資料：
Upgrade makes genome editor CRISPR more muscular, precise
Powerful enzyme could make CRISPR gene-editing more versatile
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