前言

       癲癇是發(fā)病率的神經(jīng)系統疾病之一，全世界有超過(guò)5000萬(wàn)人患有癲癇。發(fā)達國家的發(fā)病率約為每年40-70/10萬(wàn)人。在目前的治療中，大約2/3的癲癇患者沒(méi)有發(fā)生癲癇發(fā)作，但是對于另外的1/3癲癇患者，盡管已有數種抗癲癇藥物(AEDs)可供使用，但仍然沒(méi)有得到很好的控制。因此在癲癇治療領(lǐng)域始終也我們在一直期盼著(zhù)更加有效的新藥的出現。

       左乙拉西坦(Levetiracetam，簡(jiǎn)稱(chēng)LEV)是繼續卡馬西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉等傳統抗癲癇藥物之后的由比利時(shí)UCB公司開(kāi)發(fā)的第二代新型抗癲癇藥物(商品名Keppra?)。1999年12月正式批準用于16歲以上成人部分發(fā)作的輔助治療，2005年6月又將適應癥擴大到4歲以上兒童。左乙拉西坦憑借其獨特的作用機制，對于成人癲癇部分發(fā)作治療效果獲得了肯定，且耐受性良好。

       2016年1月14日和2016年2月18日歐洲醫藥管理局(EMA)和美國食品藥品管理局(FDA)分別于批準了比利時(shí)UCB公司開(kāi)發(fā)的第三代抗癲癇藥物—布瓦西坦(Brivaracetam，簡(jiǎn)稱(chēng)BRV)，商品名為Briviact?。用于治療16歲及以上部分發(fā)作型的癲癇患者，輔助治療伴隨或不伴隨繼發(fā)全身性發(fā)作。

       BRV和LEV的結構非常相似，都屬于吡咯烷酮衍生物。BRV與LEV的化學(xué)結構相比，僅僅是在吡咯烷烴的4位上連接了一個(gè)正丙基。兩個(gè)藥物就像雙子座一樣相似，以至于第一次見(jiàn)到BRV時(shí)，誤為這是一個(gè)偽創(chuàng )新產(chǎn)品，或者UCB公司為了延續LEV產(chǎn)品所來(lái)帶的市場(chǎng)輝煌所做的延續性產(chǎn)品，且不論判斷的正誤或者研發(fā)的動(dòng)機，BRV的發(fā)現背后還是存在著(zhù)深入的藥理機制研究，本文也正是想透過(guò)BRV的非臨開(kāi)發(fā)歷程和與LEV的對比優(yōu)勢來(lái)透視此類(lèi)新型抗癲癇藥物獨特的發(fā)現。

       SV2A蛋白靶點(diǎn)的發(fā)現和認知對于新型抗癲癇藥物開(kāi)發(fā)的意義

       LEV已經(jīng)上市數十年，但事實(shí)上LEV對于常用的篩選新化合物的經(jīng)典動(dòng)物模型沒(méi)有作用，這與其臨床有效性相矛盾。因此LEV的發(fā)現已經(jīng)引起了對當時(shí)開(kāi)發(fā)研究方法的一些懷疑，并且增加了在這個(gè)研究領(lǐng)域的爭論。

       在BRV開(kāi)發(fā)之前，作為L(cháng)EV和BRV靶點(diǎn)的SV2A蛋白的作用還遠遠沒(méi)有被完全理解。然而，BRV的開(kāi)發(fā)證明了SV2A蛋白結合親和力與抗癲癇作用之間的相關(guān)性，并且提高了此類(lèi)抗癲癇藥物成功開(kāi)發(fā)的可能性。SV2A蛋白的鑒定和隨后的臨床前癲癇研究方法是影響該領(lǐng)域進(jìn)展的一個(gè)里程碑，具有相當重大的意義。BRV的有效性也進(jìn)一步強化了對這一觀(guān)點(diǎn)和對新方法的需求。

       SV2A蛋白的發(fā)現和BRV的后續開(kāi)發(fā)進(jìn)一步證實(shí)了這樣一種印象：在過(guò)去的20年中，新的AEDs沒(méi)有一個(gè)能夠提高癲癇治愈患者的比例，是因為目前的藥物開(kāi)發(fā)所采用的相同動(dòng)物模型幾乎都是基于相同的假設和理論基礎。因此，為了探索新的目標藥物，迫切需要新創(chuàng )新的癲癇臨床前開(kāi)發(fā)模型。

       1. SV2A蛋白的發(fā)現叩開(kāi)了新型癲癇藥物開(kāi)發(fā)的大門(mén)

       SV2蛋白是存在于神經(jīng)元和內分泌細胞突觸囊泡中的原型蛋白質(zhì)，具有12-跨膜結構，并由三種亞型SV2A、SV2B和SV2C組成。在SV2亞型中，SV2A在包括大腦皮層、海馬和小腦在內的所有腦區域高度表達，但是也由神經(jīng)內分泌細胞和神經(jīng)肌肉接頭表達，已有研究結果表明SV2A可以調節突觸小泡的胞吐作用和突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

       BRV的發(fā)現和非臨床開(kāi)發(fā)與SV2A蛋白的發(fā)現有著(zhù)緊密的聯(lián)系，也與第一種顯示與SV2A蛋白結合的AED藥物L(fēng)EV的發(fā)現有緊密的聯(lián)系。在非臨床研究中，LEV在癲癇發(fā)作模型中顯示出對聽(tīng)源性和點(diǎn)燃性癲癇發(fā)作、6-Hz電休克和棘波放電具有保護作用。但在用于A(yíng)ED發(fā)現的標準動(dòng)物模型——電休克(MES)和戊四氮(PTZ)的模型中顯示出無(wú)效。LEV的非臨床特征與臨床研究顯示的廣譜有效性雖然相關(guān)，但其非典型抗癲癇特性表明LEV具有與傳統AED不同的作用機制。相關(guān)研究隨后揭示了LEV與SV2A蛋白的可逆的，飽和的和立體選擇性的結合，導致突觸小泡的胞吐減少和興奮性突觸中癲癇活動(dòng)期間誘發(fā)率降低的增加。從那時(shí)起，研究集中在發(fā)現靶向SV2A蛋白的新藥物上，最終導致BRV的開(kāi)發(fā)。

       2. SV2A蛋白是抗癲癇藥物的潛在好靶點(diǎn)

       一些動(dòng)物研究表明，SV2A蛋白是控制癲癇發(fā)作的一個(gè)潛在好靶點(diǎn)。

       SV2A敲除小鼠不能生長(cháng)和產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作，會(huì )在出生后2-3周內死亡。而雜合性SV2A敲除小鼠不顯示自發(fā)性癲癇發(fā)作，而顯示預癲癇特征，例如增強了對毛果蕓香堿和卡因酸(Kainate)預驚厥作用的敏感性，減少6-Hz癲癇發(fā)作的閾值和角膜點(diǎn)燃的增加率。對來(lái)自SV2A敲除小鼠的培養的神經(jīng)元的研究表明由于較低的初始囊泡釋放概率和刺激期間神經(jīng)遞質(zhì)釋放的減少，突觸后反應降低。

       在癲癇發(fā)作的動(dòng)物模型和從癲癇患者獲得的腦組織中發(fā)現了SV2A蛋白表達和功能改變，這表明SV2A蛋白表達/功能的降低促成了癲癇的進(jìn)展。

       SV2A蛋白的結合與不同癲癇發(fā)作的非臨床模型(如聽(tīng)覺(jué)癲癇發(fā)作小鼠)中的抗癲癇作用緊密相關(guān)，并且SV2A蛋白水平的下降似乎還涉及耐藥性癲癇的機制。

       所有這些證據一起表明，SV2A蛋白明確涉及癲癇的發(fā)病機制，因此可以在其治療中發(fā)揮作用。然而，SV2A的詳細功能和機制(例如神經(jīng)遞質(zhì)特異性)仍不清楚。

       BRV的發(fā)現歷程

       正如已經(jīng)提到的那樣，SV2A蛋白作為L(cháng)EV主要分子靶標的發(fā)現以及隨后對于癲癇治療潛在作用的證據促成了SV2A機制新藥的發(fā)現和優(yōu)化程序。

       新的目標是確定比LEV能更完全抑制癲癇發(fā)作的高選擇性和更有效的SV2A配體。在體外篩選了約12000種化合物的SV2A結合親和力，進(jìn)一步篩選了其中的1200種化合物對體內驚厥發(fā)作易感小鼠的癲癇發(fā)作保護作用。最后選擇了約30個(gè)化合物，并在不同的癲癇動(dòng)物模型中進(jìn)行了大量表征。這些研究發(fā)現，LEV吡咯烷環(huán)4位上的取代可以增強結合親和力。在對這個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基團替換的系統研究中發(fā)現，與LEV相比，各種小的疏水基團具有更強的SV2A親和力。并且在聽(tīng)覺(jué)癲癇發(fā)作試驗中增強了活性。在具有增強結合親和力的類(lèi)似物中，最終選擇了分子量為212的與LEV結構相近的2-吡咯烷酮衍生物BRV作為藥物開(kāi)發(fā)候選物。

       BRV的非臨床特點(diǎn)

       1. BRV具有更高的SV2A蛋白選擇性和結合力

       BRV是具有SV2A高度選擇性和可逆性的配體，具有優(yōu)于LEV的抑制突觸傳遞和囊泡釋放的親和能力。此外，來(lái)自SV2A敲除小鼠的研究結果顯示，直至600nM(測試的濃度)的濃度，[3H]BRV具有僅標記SV2A蛋白的高度選擇性。大鼠和人腦中[3H]BRV的體外結合顯示，BRV對大鼠和人SV2A顯示出了與LEV類(lèi)似的親和力(Kd為62nM)；然而對應于在癲癇動(dòng)物模型和人腦切片研究中的突觸前SV2A，BRV對于突觸后SV2A顯示出比LEV高出約15-30倍的親和力。在治療相關(guān)劑量下，BRV占據大腦中SV2A的80％至>90％。小鼠腦中的離體結合實(shí)驗顯示，BRV在給藥后5-15分鐘內達到SV2A占有率，在該時(shí)間范圍內也顯示出對癲癇發(fā)作的保護作用。

       2. BRV具有更快的腦部滲透速度

       BRV具有比LEV (LogD 0.64)更高的親脂性(LogD 1.04)，導致更快的腦部滲透速度，這與癲癇發(fā)作小鼠模型中的快速保護作用相對應。LEV的預測藥物進(jìn)入半衰期為23分鐘，而B(niǎo)RV僅為3分鐘，在藥物滲透入腦的速度上觀(guān)察到約7倍的差異。同樣，在相同聽(tīng)覺(jué)小鼠模型中的離體結合研究顯示，BRV腹膜內(i.p.)給藥后5-15分鐘內觀(guān)察到SV2A的占有率和活性，而LEV為30-60分鐘。因此，可以更快進(jìn)入大腦的BRV具有較短的作用潛伏期，這對于例如癲癇持續狀態(tài)(SE)或癲癇集群性發(fā)作的臨床緊急治療情況具有十分重要的意義。

       3. BRV具有更低的有效劑量

       使用高頻神經(jīng)元刺激來(lái)比較BRV和LEV的大鼠海馬切片研究表明，BRV增強突觸抑制，并且可以在比LEV低100倍的濃度下來(lái)減少突觸傳遞。另外，BRV在減少突觸小泡動(dòng)員方面比LEV更有效。

       4. BRV具有更高的治療指數

       BRV雖然顯示出低的治療指數(在完全點(diǎn)燃發(fā)作動(dòng)物的旋轉桿測試中運動(dòng)損傷的TD50與在相同動(dòng)物中針對廣義運動(dòng)癲癇發(fā)作保護的ED50之間的比率)，但仍然比LEV高(148比46)。在杏仁核點(diǎn)燃大鼠的旋轉試驗中，BRV具有比LEV更高的治療指數(4比2)。然而，它明顯高于經(jīng)典的和其他新型抗癲癇藥物(治療指數從2到21)。

       5. BRV具有更強的抗癲癇潛力和有效性

       體外研究表明，在兩個(gè)不同的體外大鼠海馬切片癲癇模型中，BRV具有比LEV更強的抗癲癇潛力和有效性，其劑量范圍與其臨床有效性相關(guān)。與LEV相比，BRV對SV2A親和力的增加與在不同的癲癇體內模型中觀(guān)察到的對癲癇保護作用的顯著(zhù)有效性相關(guān)。BRV的有效性已經(jīng)在包括聽(tīng)覺(jué)小鼠、斯特拉斯堡(GAERS)遺傳失神癲癇大鼠、杏仁核和角膜點(diǎn)燃模型以及缺氧后肌肉細胞的大鼠模型的部分和全面癲癇發(fā)作模型中進(jìn)行了研究。在這些模型中，BRV始終如一地表現出比LEV更有效和更全面的抑制癲癇發(fā)作。特別是，在杏仁核鼠中，BRV (6.8-210mg/kg)劑量依賴(lài)性地降低癲癇發(fā)作嚴重性，在測試劑量下幾乎完全抑制了癲癇發(fā)作。相比之下，即使在高劑量下，LEV (17-540mg/kg)也僅能提供有限的保護。在完全杏仁核點(diǎn)燃的大鼠中，BRV還能更全面地抑制運動(dòng)發(fā)作的嚴重程度和放電后的持續時(shí)間。特別是，BRV對于嚴重運動(dòng)發(fā)作的抑制劑量為21.2mg/kg，而LEV只有達到170mg/kg的劑量才能產(chǎn)生類(lèi)似效果。在測試劑量(212.3mg/kg)下，BRV也顯著(zhù)降低后續放電持續時(shí)間，而LEV即使超過(guò)1700mg/kg，對此指標也沒(méi)有任何影響。

       6. SV2A蛋白相互作用的個(gè)體差異

       在幾種癲癇動(dòng)物模型中，BRV與LEV相比所具有的更高有效性也可能是由于與SV2A蛋白相互作用的個(gè)體差異。事實(shí)上，使用SV2A變構調節劑的研究表明，BRV與SV2A的相互作用不同于LEV，BRV可能會(huì )誘導或穩定不同的SV2A蛋白質(zhì)構象，這可能提供BRV與LEV相比所不同藥效學(xué)性質(zhì)的分子原理。實(shí)際上，LEV和BRV作用于不同的結合位點(diǎn)或與SV2A蛋白具有不同構象狀態(tài)的相互作用。這可能解釋了來(lái)自大鼠海馬切片的電生理學(xué)研究的發(fā)現，其顯示BRV具有更大的抑制突觸傳遞和囊泡釋放能力。

       小結

       BRV已經(jīng)在許多癲癇實(shí)驗模型中顯示出優(yōu)異的抗癲癇活性，并且作為疾病改善作用方面具有一定的前景。臨床前研究表明，與LEV相比，BRV具有更高的有效性，因為其具有更高的選擇性，更高的親和力和不同于SV2A的結合特性，以及與更快速的腦滲透相關(guān)的親脂性。正是基于這些研究發(fā)現，觸發(fā)了進(jìn)一步臨床開(kāi)發(fā)BRV的決定。雖然目前尚無(wú)臨床研究支持BRV優(yōu)于LEV有效性的證據，我們也期待著(zhù)BRV與LEV的頭對頭臨床研究來(lái)確證BRV的臨床優(yōu)勢。

       參考文獻

       Emilio Russo, Rita Citraro & Marco Mula (2017) The preclinical discovery and development of brivaracetam for the treatment of focal epilepsy, Expert Opinion on Drug Discovery, 12:11, 1169-1178, DOI: 10.1080/17460441.2017.1366985